(一)总RNA提取
取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中，按100g:3ml的比例加入Trizol试剂，严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。
(1)加Trizol（按3ml/100mg组织，宁多勿少）置于玻璃匀浆器中匀浆后，冰浴10-15min。
(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g离心10min。
(3)上清液移至另一EP管中，室温放置10-15min。
(4)加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，振荡15s，室温置5min。
(5)4ºC 12000g离心15min。
(6)仔细吸取上层水相，移至新的EP管中。
(7)加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，振摇，置室温10min。
(8)4ºC 12000g离心10min，EP管底部可见白色沉淀物。
(9)弃上清，纸巾吸干，加入75%乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
(10)4ºC 11000g离心5min。
(11)吸尽乙醇，空气干燥10min（可离心加快干燥，尽量吸尽离心液体）。
(12)半透明时将RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混匀），-20ºC冻存备用。
(13)所提取的总RNA用核酸蛋白分析仪分析RNA含量和纯度，所有标本260/280nm吸光度的比值均为1.8-2.0。
(14)取所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的28s和18s两条rRNA。
(二)逆转录反应
DEPC水 9ul
dig primer 1ul
5×buffer 4ul
10M dNTPmix 2ul
RNA酶抑制剂 1ul
总RNA 2ul 70ºC 5min
~undefined********************************************************~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~0逆转录酶 1ul
~undefined********************************************************~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~020ul_42ºC 60min(+?)
70ºC 10min
4ºC ∞
(三)PCR反应
DEPC水（可用高压双蒸水） 17.5ul
10×Taq buffer 2.5ul
MgCl2 2.0ul
10M dNTP Mix 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
Tap酶(5u/ul) 0.5ul
总CDNA 1.0ul
~undefined*******************************************************~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~025ul~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~0PCR仪参数设置
94 ºC
5min 94 ºC ? ºC 72 ºC
30s 45s 45s 72ºC 4ºC
7min ∞
(四)电泳
(1)20ml 0.5×TBE
0.3-0.4g琼脂糖
煮沸，配成1.5-2.0%琼脂糖凝胶（RNA为1.0%）
(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室温冷切30min
(3)拔梳，加入4ulPCR产物+1ul上样缓冲液
(4)电压100-135V
(5)UVP成像系统观察
试剂配制
5×TBE配制方法（1L计）
Tris-Base 54g
硼酸 27.5g
EDTA 3.72g
加双蒸水至1L
2%琼脂糖凝胶配制方法
琼脂糖 0.4g
0.5×TBE 20ml
EB 4ul
方法的改进版：室温冷切10min，放至4ºC冰箱20min
相关技巧
1、注意反应体系的一致，可分装
2、先P内参，检验CDNA的完整性
3、首先考虑退火温度
4、注意引物的设计
5、若目的条带无法到达指定位置，可先或晚于MAKER电泳
6、通过加量或减量PCR产物来达到灰度的调整
7、必要时可行标本间替代
8、可设计相应大小的内参来达到最终目的
9、2度水浴箱的妙用
10、必要时进行相关技术处理
(责任编辑：大汉昆仑王)
