RT-PCR步骤

一、总RNA提取

1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。

4. 12000×g，4℃离心，15min。

5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。

6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。

7. 12000×g，4℃离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。

9. 7500×g，4℃离心，10min。

10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链

反应体系如下

混匀快速离心一次

反应条件如下

-20℃ 冰箱冻存

三、PCR反应

混匀快速离心一次

反应条件如下

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl  加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA  30min   溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。