正常小鼠前脂肪细胞的培养

实验材料：

1. 细胞来源：8—12天龄的小鼠；

2. 清洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.4；

3. 消化液：0.3%胶原酶溶液，含4%牛血清白蛋白。用Hanks液配制；

4. DW培养液：DMEM和WAJC404培养液按1：1（V/V）混合，添加100IU/ml青霉素、50µg/ml链霉素；

5. 培养液a：DW培养液，10%胎牛血清；

6. 培养液b：DW培养液，补充胰岛素10µg/ml、转铁蛋白10µg/ml、成纤维细胞生长因子（FGF）10ng/ml和高密度脂蛋白（HDL）溶液5µl/ml；

7. 高密度脂蛋白（HDL）溶液：含蛋白质18mg/ml和胆固醇10mg/ml；

8. 地塞米松：工作浓度为10-7 mol/L；

9. 筛网：孔径分别为250µm与80µm的尼龙网筛；

实验方法：

1. 取材；

① 取8—12天龄的小鼠，窒息处死后，置于冰块上；

② 在无菌条件下迅速切取腹股沟的脂肪垫，放入PBS液中；

③ 清除脂肪垫中的大血管和结缔组织，洗净血污。称取脂肪垫的重量；

2. 分离细胞；

① 将脂肪垫剪成1mm3 左右的小块，转入50ml锥形离心管中；

② 每0.1g组织块加入3—4ml消化液。在37℃水浴摇床上以60r/min的转速轻微振荡，消化1h。其间每隔10min取出离心管，摇动，使组织块与消化液充分混匀；

③ 消化完后，用吸管反复吹打消化液，分散组织块，制成细胞悬液；

④ 用孔径为250µm的尼龙网筛过滤细胞悬液，除去未分散的组织块，收集滤液。将滤过液再用孔径为80µm的尼龙网筛过滤，除去大部分成熟脂肪细胞，收集滤液；

⑤ 将最后得到的滤液离心（700g，7—10min）。吸弃漂浮的脂肪细胞和消化液；

⑥ 用培养液a清洗细胞，离心（700g，7min）。将细胞团制成悬液，再离心。最后，将细胞沉淀用培养液a重新制成细胞悬液。

3. 原代培养；

① 用培养液a调节细胞密度。将细胞以1.5×104个/cm2 的密度接种于培养板中；

② 24h后，用DW培养液彻底清洗细胞，除去培养物中残留的胎牛血清和未贴壁的细胞（主要为红细胞）；

③ 换入培养液b，在37℃、5%CO2 培养箱中培养。以后用培养液b维持培养。每3d换液一次；

④ 在细胞汇合成片后，继续培养；或于细胞汇合成片后第五天，在培养液b中加入10-7 mol/L地塞米松，继续培养；

⑤ 培养至出现漂浮细胞时，即可收货细胞，进行鉴定。