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        着床前小鼠胚胎的获取与培养

        相关实验:着床前小鼠胚胎的获取与培养

        最新修订时间:

        简介

        小鼠的发育起始于受精卵的形成,其胚胎发生的早期发育与比其他模式生物慢很多。小鼠胚胎处于2-细胞期在没有明显体积增大的情况下缓慢卵裂,并沿输卵管向子宫移动,直至受精4.5天后植入子宫。


        在此过程中,受精卵经桑椹形成(compartion)成为一个实心的细胞球-桑椹胚(morula)。桑椹胚外部形成滋养外胚层(tmphectoderm),未来将分化为胚胎的附属结构如胎盘;内部则形成内部细胞团(inner cell mass,ICM),内部细胞团的一部分发育为胎儿。


        在受精后5-10天,3个基本的胚层:外胚层、中胚层和终末内胚层(区别于原始内胚层)通过原肠作用产生,未来小鼠的基本身体结构和器官原基也建立起来。

        材料与仪器

        器材:


        ①一次性无菌塑料容器
        ②移卵管

        ③培养箱


        试剂:


        ①材料:小鼠
        ②胚胎培养液
        ③石蜡
        ④hCG
        ⑤抗生素

        步骤

        显微受精技术的基本过程可分为如下几步:


        一、着床前小鼠胚胎培养的准备


        1.配液时,最好使用一次性无菌塑料容器和移卵管。胚胎培养液的保存一般不应该超过1周(最长2周)。新鲜的培养液应该在1周或者2周内准备。


        2. 培养用的培养滴应该在培养前4~6小时或提前1天制作。覆盖液体石蜡有助于培养液稳定并减少蒸发(蒸发可导致渗透压增加),以及减少由培养箱外操作引起的温度和pH变化。一般用20~50 μl培养滴。


        3. 对于长期培养箱外操作的实验,或者体外受精,建议维持显微培养滴在37 ℃比较好。用于收集、操作及培养胚胎的培养液都含有抗生素,并经过过滤除菌。


        二、胚胎收集


        1.按照人性化的要求与方法脱颈椎处死小鼠并分离出卵巢。


        2.合子可以在显微注射前几小时收集。当小鼠饲养在光暗周期的环境下,在中午前收集合子就很方便。在超排的情况下,hCG注射后21~25小时,在交配后第2天清晨检测到阴道栓(0.5 dpc)时收集合子。体外受精时所用的没有受精的、由卵丘细胞包裹的卵子可以同样的方式收集。


        3. 2~8细胞阶段的胚胎在输卵管中存在20-60小时时,胚胎已经完全去掉了卵丘细胞,可以用少量的M2培养液将其从输卵管中冲洗出来。


        供体雌性小鼠超排之后,2-细胞阶段的胚胎在hCG注射后45-48小时收集(1.5 dpc);8-细胞到致密化的桑椹胚在hCG注射后67~77小时(2.5 dpe)收集。

        来源:丁香实验

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