正常小鼠肾间质成纤维细胞的培养

实验材料：

1. 肾组织：取自8周龄健康雌性小鼠；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 0.1%明胶：为生长基质成分，在取材前先用它包被培养瓶的生长面；

4. 消化液：0.1%胰蛋白酶溶液；

5. 培养液：DMEM培养液，补充20%的胎牛血清、成纤维细胞生长因子（α-FGF）2µg/ml、庆大霉素100µg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素100µg/ml；

6. 用于细胞鉴定的抗体：抗细胞角蛋白（cytokeratin）抗体、抗角蛋白（keratin）抗体、抗波形蛋白（vimentin）抗体、抗结蛋白（des min）抗体、抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscular actin，α-SMA）抗体；

7. 眼科剪、眼科镊等无菌消毒手术器械；

8. 网筛：100目、150目；

9. 离心管（15ml、50ml）；

实验方法：

1. 取材；

① 断颈处死小鼠，在无菌条件下迅速取出肾脏，用生理盐水冲洗干净，剥离肾被膜；

② 切取肾皮质，将皮质组织剪成2—3mm的细条。在100目不锈钢网筛上轻轻研磨，并用生理盐水冲洗，收集滤液。将滤液再用150目的网筛过滤，收集网筛上富含肾小管的间质碎片；

③ 在倒置显微镜下观察收集的间质碎片，其中应主要为肾小管节段。如果混有较多的肾小球，则须将收集到的间质碎片再放置到150目网筛上冲洗，直至肾小管纯度达98%以上后才进行下面的步骤；

④ 用培养液悬浮收集的肾小管节段；

2. 接种与培养；

① 将肾小管节段悬液加入已用明胶包被的培养瓶内。于37℃、5%CO2 培养箱中培养。每4—5d换液一次。

② 待细胞长满瓶壁后，用0.1%胰蛋白酶消化传代。每4—5d传代一次，通常连接传代至第三代时即可获得较纯的成纤维细胞。一般可传10代左右；