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        【共享】冰冻切片的免疫组化染色操作步骤

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        1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存),厚度为 5~6m。 2. 载玻片可不打底,裱片后,立即用电吹风吹干。 3. 如不马上染色,可密封后- 20℃保存。 4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。 5. PBS 洗 2 次,每次 5 分钟,( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

        1. 新鲜组织立即在恒冷
        冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存),厚度为 5~6μm。

        2. 载玻片可不打底,裱片后,立即用电吹风吹干。

        3. 如不马上染色,可密封后- 20℃保存。

        4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。

        5. PPS洗 2 次,每次 5 分钟,( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

        6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20 分钟,避光;

        7. 用 PBS 洗 2 次,每次 5 分钟;

        8. 正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理,37℃,15 分钟。

        附:正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

        9.滴加第一抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

        10.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

        11.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分钟。

        12.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

        13.滴加三抗 (SAB 复合物) ,37℃,40 分钟。

        14.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

        15.DAB 显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止) 。

        附:DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分装成 1ml,100μl,50μl ,20μl 等,-20℃,冻存。② 工作液:DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

        16.自来水(细水)充分冲洗。

        17.苏木素复染,室温,30 秒,自来水冲洗。

        18.自来水冲洗返蓝,15 分钟。

        19.梯度酒精脱水:80%,2 分钟 95%,2 分钟 100%,2 次,5 分钟。

        20.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分钟

        21.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。

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