冰冻切片免疫组化染色

相较于石蜡切片，冰冻切片具有制片快速、抗原活性好的优势，在免疫组化染色中无需进行脱蜡和抗原修复。主要流程包括：样本前处理、封闭、一抗孵育、二抗孵育、酶底物显色或荧光检测、封片观察等步骤。

图：冰冻切片免疫组化染色流程图

 

以直接取材为例，展示冰冻切片组化染色实验流程：

1、实验前处理

冰冻切片取材可分为动物灌流固定和直接取材：

动物灌流固定：

a.通常采用预冷的 1xPBS 灌流冲洗至血液全部放出，随后灌注4%多聚甲醛直至小鼠僵直，而后解剖获取组织；

b.置于 4℃，4% 多聚甲醛中固定 1 h 左右；

c.1xPBS 清洗后，25% 蔗糖溶液脱水 12 h 左右包埋即可，可根据实际情况判断是否需要进行抗原修复。

直接取材切片：

组织切片晾干后，选择合适的固定剂固定，如 10% 中性福尔马林缓冲液、冷冻丙酮、甲醇、3% 甲醛等，通常不需要进行抗原修复。 

2、封闭处理

a.阻断内源性过氧化物酶：轻甩去载玻片上的液体，用吸水纸吸干组织切片周围残留的液体。使用疏水性免疫组化笔在组织切片周围的载玻片上画一个圆圈。根据组织大小滴加适量内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育 10～20 min，阻断完成后用 PBS 清洗载玻片，清洗 3 次，每次 3 min。

b.（可选）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 min。甩去多余液体。

3、一抗孵育

根据组织大小，滴加 100 μl 或适量的一抗，4℃ 过夜孵育或室温孵育 1～2 h，孵育完成后，PBS 清洗 3 次，每次 3 min。

4、二抗孵育

滴加适量微聚物二抗，室温孵育 20 min，PBS 清洗 3 次，每次 3 min。

5、DAB 显色

DAB 工作液配制：在进行 DAB 显色前配制工作液，每 1 ml DAB Buffer 加入 100 μl DAB Solution (10×)，混匀后，避光保存，建议在 30 min 内用完。 滴加适量新配制 DAB显色液，室温孵育 1～5 min，合理控制反应时间，防止染色过深，染色完成后使用 H₂O 冲洗 10 min。

6、复染与反蓝

苏木素染色孵育，染色完成后，使用 H₂O 冲洗 10 min。

7、脱水、封片

切片置于 70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇和二甲苯各 3 min脱水。将已透明处理的切片取出，滴一滴中性树胶至组织切片中央，将盖玻片一端放置于切片上，缓慢将盖玻片放下并覆盖所有组织，避免气泡产生，置于通风橱内晾干。

8、阅片