定磷法测定核酸的含量

【 实验目的 】

掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法

【 实验原理 】

核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。

核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为：

在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。

【 实验材料 】

1.实验器材

恒温水浴,721分光光度计

2.实验 试剂

（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400µg，临用时准确稀释20倍(20µg／m1)。

（2）定磷 试剂

① 17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。

②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。

③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。

临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V)

（3）5%氨水, 27%硫酸

【 实验操作 】

1．磷标准曲线的绘制

取干燥 试管 7支编号，按表所示加入试剂。

试剂	管号
0	1	2	3	4	5	6
磷标准溶液，ml	0.0	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
蒸馏水，ml	3.0	2.95	0.9	2.8	0.7	2.6	2.5
定磷试剂，ml	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
A 660

加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。

2．总磷的测定

称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。

吸取上述核酸溶液1.0ml，置大 试管 中，加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加热至溶液透明(切勿烧干)，表示消化完成。

冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸馏水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3m1溶液置试管中，加3m1定磷试剂，45℃ 水浴 保温10min后取出, 测A 660 。

3．无机磷的测定

吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0ml置试管中，加定磷试剂3.0m1，45℃ 水浴 中保温10min后取出, 测A 660 。

4．结果处理

总磷A 660 －无机磷A 660 =有机磷A 660

从标准曲线上查出有机磷微克数(X)，按下式计算样品中核酸百分含量

【 实验结果讨论 】

【 思考 】