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        测定用乙醇固定的 DNA 的含量

        相关实验:测定用乙醇固定的 DNA 的含量

        最新修订时间:

        原理

        DNA和RNA在260nm处有一很高的吸收峰,利用这个原理我们测其OD260,再推算出其浓度。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、培养细胞的 DNA 含量的测定


        制备单细胞悬液于 200μ l 的 PBS 缓冲液中; 加入 2ml 预冷的 70%乙醇,4℃保存;


        1. 取单细胞悬液 1——2×106 个细胞于 PBS(PH=7.2)缓冲液中;


        2. 300g 离心 5 分钟,弃上清,反复两次;


        3. 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中;


        4. 将细胞悬液放置于 2——3ml 冷 70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30 分钟。 在 4℃条件下可保存 2——3 周。


        2、新鲜组织的 DNA 含量的测定


        1. 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液;


        2. 500g 离心 5 分钟;


        3. 弃上清,重悬于 10ml 染色- 去污剂中;


        4. 再过滤,用 200 目的筛网或 70——80μm 的筛网过滤;


        5. 上机检测。


        3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定


        1. 从石蜡包埋切取切片 50 μ m 厚,2——3 片,制成单细胞悬液;


        2. 用 PBS 缓冲液洗涤,500g 离心 5 分钟,弃上清;


        3. 加入 PI 液 1ml 室温避光 30 分钟;


        4. 调整细胞浓度为 1×106/ml;


        5. 上机检测。

        注意事项

        1. 根据实验的要求,固定剂也可选用 1——3%多聚甲醛;


        2. 将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至 0——4℃;


        3. 细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增 加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时) .

        常见问题

        如果想要检测样品的纯度,那么还要再测一次280nm处OD值,计算二者的比率,若比率接近2,说明样品纯度较高。

        来源:丁香实验

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