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        核酸的定量测定——定磷法

        互联网

        12877

        核酸的定量测定——定磷法

        [原理]

        磷的测定方法很多,Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法,它具有灵敏、简便的特点。各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解,使有机磷消化成为无机磷。无机磷在酸性条件下,与钼酸盐(常用钼酸铵或钼酸钠)反应生成磷钼酸盐络合物。

        用还原剂处理,磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝,在660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内,颜色的深浅与磷含量成正比关系。因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。

        化学反应式:

        (NH 4 ) 2 MoO 4 + H 2 SO 4 → H 2 MoO 4 + (NH 4 ) 2 SO 4

        H 3 PO 4 + 12H 2 MoO 4 → H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 + 12H 2 O

        还原剂

        H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 → Mo 2 O 3 MoO 3

        核酸是一类含磷化合物,其分子含有一定比例的磷,一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%;DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%,即每100g核酸含有9.0~9.2g磷,也就是核酸量是含磷量的11倍左右,故测得磷的量,即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依据,磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。

        生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质,故用定磷法来测定该有机磷物质的量时,必须分别测定该样品的总磷量,即样品经过消化以后所测得的含磷量,以及该样品的无机磷含量,即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。

        [方法和步骤]

        1、 磷标准曲线的绘制

        取试管7支,0~6依次编号。按下表加入各 试剂 。注意每加好一种 试剂 后应立即摇匀。

        管号

        名称

        0

        1

        2

        3

        4

        5

        6

        标准磷溶液/mL

        0

        0.5

        1.0

        1.5

        2.0

        2.5

        3.0

        6 mol/L 硫酸/mL

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        25g/L钼酸铵/mL

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        0.5

        还原剂/mL

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        0.1

        蒸馏水/mL

        3.9

        3.4

        2.9

        2.4

        1.9

        1.4

        0.9

        各反应液加毕后,于30℃保温20min,置分光光度计中在波长660nm比色,测光吸收值。以磷含量为横坐标,光吸收值为纵坐标作图,即得定磷标准曲线。

        2、总磷量的测定

        取30毫升凯氏烧瓶2只,Ⅰ、Ⅱ依次编号,Ⅰ号瓶为空白对照,用刻度吸管准确吸取核糖核酸样液1.0mL,置于Ⅱ号凯氏烧瓶内,Ⅰ号瓶加入蒸馏水1.0mL,不加样液,两瓶分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加热消化,待溶液呈褐色,稍加冷却,加入2 mol/L硝酸2滴,再继续加热,直至逸出白色烟雾,溶液无色透明,表示消化完成时为止。

        待凯氏烧瓶冷却后,分别加入1.0mL蒸馏水,置沸水浴蒸煮5min,使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出,待其冷却,将Ⅰ和Ⅱ号瓶内的消化液分别移入两只10毫升容量瓶中,用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次,并将洗涤液一并倒入容量瓶内,再各加蒸馏水稀释至刻度。

        取试管3支,按7~9依次编号,7号管为空白对照。

        准确吸取空白对照液1.0mL,置于7号管内,再分别准确吸取Ⅱ号瓶经过消化的核糖核酸样液1.0mL,置于8、9号管内,以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度,即可由绘制的标准曲线查得核糖核酸经消化稀释后的总磷量。

        3、无机磷的测定

        取试管3支,按10~12依次编号,10号管为空白对照。

        用刻度吸管分别准确吸取未经消化的核糖核酸液1.0mL,作为无机磷测定样液,置于11、12号管内,空白管以蒸馏水代替RNA液,以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度,即可由绘制的标准曲线查得无机磷含量。若溶液浑浊,影响测定光密度,可在加入试剂摇匀后,进行过滤或置 离心机 3 000r/min离心15min,取其上清液再测定。

        4、有机磷的测定

        按上述方法分别测得总磷和无机磷的光密度,自总磷的光密度扣除无机磷的光密度,即为消化稀释后样液有机磷的光密度。

        再由磷标准曲线查得有机磷含量。

        [计算结果]

        计算样品中核酸的含量。

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