过碘酸-雪夫染色的原理及操作步骤

实验原理

胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodicacid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。该反应称为过碘酸-雪夫 (PAS)阳性反应，以前也称为糖原染色。

实验试剂

1. 高碘酸氧化液：

HIO4 ·2H2 O1g,

蒸馏水加至100ml。

此液溶解后保存于冰箱中待用。

2. Schiff试剂：

将1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中。摇荡5分钟，冷却至60度左右，过滤，并向滤液中入1mol/LHCl20ml，混匀。冷至 250C时，加2g偏重亚硫酸钠（或钾）（Na2 S2 O5 ）。将此液置带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24小时。加1g活性碳，摇动1分钟，滤纸过滤。保存于冰箱中。

3. 亚硫酸液

100g/L偏重亚硫酸钠6ml

1mol/L盐酸5ml

蒸馏水100ml

每次用前新鲜配置。

4. 20g/L甲绿

甲绿2g

蒸馏水加至100ml

5. 淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液离心取上清液，内含淀粉酶，将麦芽糖淀粉酶0.1~1.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0）100ml中。

实验步骤

1. 固定新鲜干燥的涂片用品5%乙醇固定10min，蒸馏水冲洗，待干；

2. 如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60min，然后用蒸馏水冲洗；

3. 10g/L高碘酸氧化15～20min,蒸馏水冲洗，待干；

4. 置雪夫染液中室温染色30～60min；

5. 用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗2～3min，待干；

6. 20g/L甲绿复染10～20min；

7. 水洗，待干，镜检。

8. 实验结果计算

1) 中性粒细胞糖原含量参考标准：

　　（-）胞质无颗粒

　　（ ）胞质呈淡红色，无颗粒

　　（ ）胞质呈红色，有少量颗粒

　　（ ）胞质呈暗红色，颗粒较密

　　（ ）胞质呈紫红色，颗粒极密

2) 淋巴细胞系：

大多数淋巴细胞呈阴性反应，少数为（ ）的阳性反应。

　　淋巴细胞糖原含量程度参考标准

　　（-）胞质内无颗粒

　　（ ）胞质内有颗粒

　　（ ）有较粗红色颗粒

　　（ ）有粗大红色颗粒

　　（ ）颗粒粗大并有红色块状

3) 红细胞系：

　　幼红细胞和红细胞呈阴性反应

　　红细胞系列糖原含量程度参考标准

　　（-）胞质无颗粒

　　（ ）有少数红色颗粒

　　（ ）有较粗红色颗粒或弥漫红色

　　（ ）有粗大红色颗粒或深红色

　　（ ）有粗大红色块状或紫红色

4) 巨核细胞：

　　巨核细胞和血小板染色反应均为阳性

　　巨核细胞糖原含量程度参考标准

　　（-）胞质无颗粒

　　（ ）少量糖原包涵体

　　（ ）中等量糖原包涵体，定位于核膜出或分散胞质中，占胞质1/3

　　（ ）大量糖原包涵体分散于胞质的1/2

　　（ ）糖原包涵体充满整个胞质

　5) 单核细胞呈阴性或阳性，颗粒细小，往往位于胞质边缘：

　　浆细胞大多呈阴性，少数为红色颗粒阳性；

　　组织细胞为阴性反应；

　　巨噬细胞可呈阳性，为红色颗粒反应。

注意事项

1. 所用染色缸及器具应十分清洁、干燥；

2. 固定试剂不同，染色效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲醛蒸气，其中乙醇固定后糖原颗粒明显，各成熟粒细胞的反应有较明显的颜色差异，易于判断阳性反应的程度，且唾液消化后的对照标本没有假阳性，故通常选用乙醇为固定剂；

3. 10g/L高碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用，氧化时间要准确，否则将导致假阳性或假阴性；

4. 碱性品红试剂对染色的影响不同品牌的碱性品红染色效果不一，碱性品红的质量是试验成败的关键因素之一。希夫(Schiff)染液应避光保存，无色，变红则失效；

5. 染色后标本应及早观察和记录，染色后标本保存8天后，将逐渐褪色，保存时间延长，褪色更为明显