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        核糖核酸酶保护分析

        互联网

        4509
        一、体外转录

        在无菌1.5 ml 微型离心管中,结合以下内容:

        4 ul 5倍转录缓冲液

        2 ul 0.1 M DTT

        4 ul 2.5 MM NTP(A,C,G)

        0.8 ul RNA酶抑制剂(25 U/ul)RNA酶抑制剂(Promega)中
        100 UM冷UTP

        1 ul/ug UL线性DNA模板

        5 ul 10 UCI / UL P32 UTP(800Ci/mmol)

        1 ul RNA聚合酶SP6,T7或T3

        总体积〜20 ul。

        孵育1小时,37℃。

        2 ul 每个转录的DNA酶I,孵育20分钟, 37℃。

        二、探头净化

        净化探头使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱(G50葡聚糖凝胶)。检查1 ul 在闪烁计数器,P32通道。一个很好的探头将5×105~1×106 CPM。

        三、杂交

        打开heatblock到95C。对于在水或乙醇中的样品,干燥适当的RNA量,并包括一个管与1 ul tRNA或糖原(Sigma公司),这是作为阴性对照。

        每个样品应具有以下:

        24 ul 甲酰胺

        2 ul 0.6 M管

        2.4 ul 5 M氯化钠

        0.3 ul 0.1 M EDTA

        2×105 cpm探针

        5×104 cpm加载控制探针
        DEPC水

        总体积30ul

        以及混合样品。加热95℃,10分钟。孵育4小时, 55°C。

        四、RNase消化

        核糖核酸酶消化缓冲液:

        300 MM 醋酸钠

        10 mM 的TRIS

        5 mM EDTA

        每个样品添加350 ul 消化缓冲液。

        1 ul 4 mg/ml 核糖核酸酶A和0.4 ul 10 u/ul 核糖核酸酶T1。

        孵育,30℃,45分钟至1小时。

        五、蛋白酶K

        向每个样品中添加20%SDS和2.5 ul 的10 mg/ml 的蛋白酶K孵育,37℃ 10 μl 的15-20分钟。

        六:清理

        提取一次400 ul 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)

        将上清转移到新的试管中。加入1000 ul 的100%乙醇和1 μl 为10 mg/ml 的糖原。拌匀。

        在-70℃,30分钟或在干冰/ ETOH浴中10分钟孵育样品。

        旋转的离心15分钟。吸EtOH。让小球在空气中晾干。

        重悬在8 ul 甲酰胺的装载染料。允许坐在RT 5-10分钟,经常搅拌。

        七:聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

        热样品5分钟,100℃。加载到5%polyacrylamide/7 M尿素变性凝胶2000 cpm 的分子量标记物。运行凝胶38-42mA。干凝胶,暴露于膜O / N在-70C增感屏。

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