核酸酶保护

1.  在一个高压过的微量离心管中建立20 μl 的反应复合物如下：

（1）4 μl  5×转录缓冲液

（2）1 μl  200 mmol/的3NTP混合液

（3）10 μl  ［α-³²P］CTP

（4）1 μl  胎盘核酸酶抑制剂

（5）1 μl  1 mg/ml 模板DNA

（6）1 μl  噬菌体RNA聚合酶

（7）SP6 RNA聚合酶反应时在40℃保温30~60 min。采用T7或T3 RNA聚合酶则在37℃温育。

 

2.  加人5 μg 或10 U 无RNA酶的酶 I，37℃温育15 min。

3.  加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA，补水至50 μl，以酚/氯仿/异戊酵抽提。

4.  水相加入200 μl，2.5 mol/l 乙酸铵和750 μl 无水乙醇，混匀后在冰浴饭置15 min，于4℃在微量离心机中离心15 min。

 

5.  重溶于50 μl 水，按第4步操作所述重新沉淀两次，最后得到的沉淀以75%乙醇/25% 0.1 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液洗涤，晾干沉淀并溶解于100 μl 杂交液，取1 μl 计数。

 

6.  RNA以乙醇沉淀，并溶解于30 μl 含5×10⁵ cpm RNA探针的杂交液中，于85℃加热变性5 min，移至设定的杂交温度（30~60℃），温育8 h 以上。

7.  加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化缓冲液，于30℃温育30~60 min。

8.  加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K，37℃温育30~60 min。

9.  用400 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的离心管中，加入1 ml 乙醇沉淀，晾干后溶解于3~5 μl RNA加样缓冲液中。

10.  于85℃加热变性3 min，在变性的聚丙烯酰胺/尿素凝胶（序列胶）中电泳，用增感屏放射自显影过夜，分析结果。