噬菌体扩增及滴度测定
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请教有关噬菌体分离扩增测滴度纯化等的相关问题，首先是如何从污水或标本中获取，可能这些问题比较傻，但是本人是新手，敬请指教，不要取笑！谢谢！
我们实验室的噬菌体扩增及测滴度方法：
第一天：
17：00后用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中，370C摇床过夜（不要超过16小时）
第二天：
7：30打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中）
8：00将20ML的LB培养液放入250ml的三角烧瓶中，按1：100的比例稀释过夜培养的细菌（即放入200ul 的细菌液体），将其放入370C摇床，培养约3.5个小时
11：00打开紫外灯，照射半小时
11：30取10ul阳性噬菌体液加至20ml细菌培养物中（早期对数生长期），再放入摇床中370C剧烈摇动（300转/分）4.5小时
15：30打开紫外灯，照射半小时。同时让高速离心机预温。
16：00将三角烧瓶中培养物转至一离心管中，40C 10,000rpm离心10min，将上清转至另一干净离心管中，再次离心。吸取部分上清按1：1的比例和甘油混合保种，放在－200C保存。吸取80％上清至另一离心管中，加1/6体积PEG/NACL，于40C过夜。
17：00用接种环取一单克隆细菌接种于LB培养液中，370C摇床过夜（不要超过16小时）。
第三天：
7：30打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中）
8：00按1：100的比例稀释过夜培养的细菌（将50ul的细菌培养物放入5mlLB中）将其放入370C摇床，培养约3.5小时
8：30打开紫外灯，照射半小时（将器械放入通风橱中），同时让高速离心机预温。
9：0040C10,000rpm离心15min，弃上清。加1mlTBS重悬沉淀，并转移至微量离心管中，加1/6体积的PEG/NACL再次沉淀，在冰上孵育15－60min，离心弃上清，加200ulTBS重悬沉淀，此为阳性噬菌体扩增液。经几轮扩增至所需的滴度。
10：30将IPTG/Xgal平皿板放入370C恒温箱中预温，准备水浴箱等测滴度用品。
11：00用LB培养液以100/1000倍系列稀释噬菌体。微波炉中溶化顶层胶，每3ml分装在一个无菌培养管中，每个稀释度的噬菌体一个，将这些培养管置于450C水浴中备用。
11：30每200ul细菌培养物分装到微量离心管中。每个噬菌体稀释度10ul分别加到上述细菌培养物中，室温下孵育1－5分钟。转到上述含顶层胶的无菌培养管中，快速混悬，立即铺到预温的LB/IPTG/Xgal平皿上，倾斜平皿使顶层胶铺匀。室温下冷却平皿5min，倒置，370C培养过夜。
第四天：
噬斑计数，以每个平皿100个左右为最佳的稀释度。
噬菌体滴度＝噬斑数×稀释度（pfu/10ul）
