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        免疫染色法滴度测定

        最新修订时间:

        原理

        MVA 病毒滴度通常是用免疫染色法进行测定,因为 MVA 不能在 CEF 或 BHK-21 细胞中形成噬斑。

        材料与仪器

        步骤

        1. 胰酶消化用 150 cm2 组织培养瓶培养的 CEF 或 BHK-21 细胞(见「细胞培养实验」基本方案 1 步骤4~6 ),对较大的组织培养瓶用 1.5 ml 胰酶/EDTA 消化。用 5 ml 的完全 MEM-10 培养基重悬细胞,另加入 60 ml 的完全 MEM-10 培养基。

        2. 在 6 孔的 35 mm2 组织培养板每孔中加入 2 ml 的细胞悬液,在加湿的 5% CO2 培养箱中 37°C 培养过夜至接近单层生长至汇片的程度。

        3. 吸出培养基,加入 2 ml 完全 MEM-2.5 培养基。

        4. 取出 MVA 病毒储液,在冰上超声破碎 30 s。

        5. 用完全 MEM-2.5 培养基对病毒进行 8 次 10 倍系列稀释,注意每次稀释必须用新的吸管。

        6. 用 0.1 ml 10-6、10-7、10-8 病毒稀释液感染细胞,每个稀释度感染两个孔,旋转混匀,放入 CO2 培养箱中 37°C 培养 24 h。

        7. 吸出液体,将细胞用 1 ml 1:1: 丙酮/甲醇固定 2 min。吸出固定液,每孔加入 2 ml PBS,立即免疫染色培养板,也可以将培养板在 4°C 存放数周后使用。


        8. 用含 3% FBS 的 PBS 稀释兔抗痘苗病毒抗体,每孔加入 1 ml。室温温育 1 h,期间并不时轻轻晃动。


        9. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。


        10. 用含 3% FBS 的 PBS 稀释辣根过氧化物酶偶联的抗兔 Ig 抗体,每孔加入 1 ml。室温温育30~45 min,期间不时轻轻晃动。


        11. 用 2 ml 的 PBS 清洗 2 次。


        12. 用 0.5 ml 的乙醇制备邻联茴香胺饱和溶液,涡旋混匀,37℃ 下放置 5 min,以最大转速离心 1 min 澄清溶液,加入 0.2 ml 的邻联茴香胺溶液到 10 ml 的PBS/H2O2 中。同样,也可以按照操作手册使用底物片剂。


        13. 每孔加入 0.5 ml 的邻联茴香胺底物溶液,轻轻晃动,放置10 min (弱抗体需要的时间长)。用显微镜观察感染细胞的噬斑,反应完成后,用水洗培养板,并加入 1 ml 的水使其保持湿润。


        14. 对染色的噬斑进行计数,乘以稀释倍数,得到的滴度表示为感染单位(pfu)/ml。


        注意事项

        1. 邻联二茴香胺有致癌作用,操作时应该戴手套并在通风橱中进行。30% H2O2 对皮肤有腐蚀性,应戴手套操作。


        2. 每个抗体的最佳稀释倍数必须以经验确定,但最好开始按 1:500 或 1:1000 稀释。


        3. 每孔中有 20~100 个噬斑可以获得较好的结果。在确定滴度时,应当乘以10,因为每孔只加入了 0.1 ml的病毒量。

        来源:丁香实验

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