多重替代扩增

多重替代扩增，是基于链替代扩增方法创建的扩增全基因组的方法。

多重替代扩增的基本原理是链替代扩增 (strand displacement amplification, SDA) 是应用滚环扩增 (rolling cycle amplification, RCA) 的方法，既可用于信号的放大也可用于目的基因的扩增。Dean F. 等基于链替代 扩增方法原理创建了 MDA, 用于扩增全基因组 (见图 13-11)。该方法利用φ29DNA聚合酶和随 机六聚体引物对人基因组进行扩增，可以直接从生物样品如全血、组织培养细胞中扩增，在常温 等温下扩增，避免了高温下 DNA 降解对扩增产物质量的影响。φ29DNA聚合酶具有的主要特性 如下：①具有非常高的向前延伸的活性，且与模板紧密结合，能高效合成 DNA, 每一次结合到 DNA 链上可以引导 70000个碱基掺入。这样随机起始合成有代表性的基因组DNA 不会受序列本 身的碱基组成、短的串联重复序列或二级结构影响，使得在存在复杂的一级和二级结构的情况下 PCR反应仍能顺利进行高效的DNA 合成，最大限度减少了链转换和二级结构形成。②支持链取 代 DNA 合成。下游的互补链被酶取代出来成为单链，并可以作为下一步随机六碱基引物的起始 模板。③φ29DNA聚合酶 3'→ 5'外切酶活性，其有高保真纠错功能，报道的错误率仅为 10-5〜 10-6, 约比 Tg 聚合酶低 100 倍。 所以与 DOP-PCR 和PEP-PCR 比较，MDA 无论是扩增的效 率，还是扩增的可信度都明显优于DOP-PCR和PEP-PCR, 能均匀扩增全基因组，而没有明显的 偏移；MDA 可以从 1〜10个拷贝的基因组DNA 扩增出 20〜30 μg 的产物，DNA 产物的平均长度 大于10kb。 MDA 具有的这些优点使 MDA 适合多方面的应用，包括定量 PCR、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)基因分型、Southern blot 分析及染色体图谱的绘制等。 MDA 不需要从微生物样品中分离基因组DNA 就可直接进行扩增，并可用于DNA序列分析。因 此，MDA 是扩增难以分离培养的生物样品基因组DNA的首选方法；MDA 也可用于从可疑感染 的组织中扩增微生物基因组DNA, 如关节炎。

多重替代扩增的基本过程可分为如下几步：

（一）反应体系： 基因组 DNA : l00fg—300ng；引物：50μmol/L (5』-NpNpNpNpsNps N-3』, 巯基磷酸修饰，核酸外切酶抗性)；lmmol/L dNTPs； 10 mmol/L MgCl2 ； 37 mmol/L Tris-HCl, pH7.5； 50mol/.L KC1； 5 mmol/L (NH4)2SO4; 酵母焦磷酸酶 lU/ml；φ29DNA 聚合酶 800U。

（二）扩增条件 30°C孵育18 h, 扩增结束后 65°C 3 min 灭活。

MDA的扩增效率也决定于模板的质量，不同模板扩增效率差别很大。随着模板 DNA 分子 量的降低，扩增产物的量也下降。因此，该方法对于降解的DNA, 如甲醛固定组织或低分子量 DNA 并不是最理想的选择。