免疫荧光技术简介

1、荧光免疫测定技术的概念

将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。

2、技术分类

（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。

（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。

3、荧光的产生

物质吸收外界能量而进入激发状态，在恢复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。 由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术 ； 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术。

4、荧光素的荧光特性

（1）停止供能，荧光现象随即终止。

（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性。入射光波长

（3） 荧光效率： 发射荧光的光量子数
荧光效率=---------------------------
吸收光的光量子数

（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱。

5、常见荧光素及其特性

（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光490~495nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光。

（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。

（3）TRITC：紫红色粉末，吸收光550nm，发射光620nm，橙红色荧光。

（4）镧系：Eu3+、Tb3+等。

（5）PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。

（6）其它：酶作用后产生荧光物质，具体如下表：

酶 底物 产物 激发光 发射光
B-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚体 317 414

6、合适荧光素的选择

（1） 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。

荧光素-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质
‖ ︱ ︱‖ ︱
S H H S H

（2）荧光效率高，标记后下降不明显。

（3） 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。

（4）标记后能保持生物学活性和免疫活性。

（5）标记方法简单、快速。

（6） 安全无毒。