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        活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备

        相关实验:活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备

        最新修订时间:

        原理

        活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

        材料与仪器

        步骤

        制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用本法)


        1. 用10% FCSRPMll640 调整细胞浓度为5×106—1×107/ml


        2. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异McAb(5——50 μl)的小玻璃管或塑料离心管,再加50 μl 1:20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清。


        3. 4℃静置30 min。


        4. 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2 ml,1000 r/min×5 min。


        5. 弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇。


        6. 4℃静置30 min。


        7. 用洗涤液洗涤2次,每次加液2 ml,1000 r/min×5 min。


        8. 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入1 ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,视细胞浓度加入100—500 μl固定液)


        9. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察,(标本在试管中可保存5——7天)

        注意事项

        1. 整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。


        2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。


        3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。


        4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。

        常见问题

        来源《实验动物与动物实验方法学》

        来源:丁香实验

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