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        活细胞免疫荧光技术-流式细胞仪标本的制备

        相关实验:细胞表面标记的检测技术

        最新修订时间:

        原理

        活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

        材料与仪器

        步骤

        1.  制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
                        
        2.  用10 %FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×106~1×107 /ml
                
        3.  取40 μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5~50 μl)
        的小玻璃管或塑料离心管,再加50 μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清,4 ℃ 30 min
                
        4.  用洗涤液洗涤2 次,每次加洗涤液2 ml左右,
        1000 rpm×5 min
                 
        5.  弃上清,加入50 μl工作浓度的羊抗鼠(
        或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇,4 ℃ 30 min
                 
        6.  用洗涤液洗涤2 次,每次加液2 ml左右,
        1000 rpm×5 min
                         
        7.  加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入1 ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,视细胞浓度加入100~500 μl固定液)
                     
        8.  FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5~7 天)
          

        注意事项

        1.  整个操作在4 ℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
          
        2.  洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴
        性。
          
        3.  加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非
        特异性染色。
          
        4.  细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。

        常见问题

        一、附录
          
        1.  DPBS (×10, 贮存液)

         
        NaCl 80 g,KCl 2 g,蒸馏水加至1000 ml,Na2HPO4 11.5 g,临用时用蒸馏水1∶10稀释,KH2PO2 g
          
        2.  洗涤液

         
        DPBS 900 ml,FCS 50 ml(终浓度5 %),4 % NaN3 50 ml(终浓度0.2 %)
          
        3.  固定液

         
        DPBS 1000 ml,葡萄糖 20 g(终浓度2 %),甲醛 10 ml,NaN3 0.2 g (终浓度0.02 %)

        来源:丁香实验

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