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        关于稳定转染的若干问题

        互联网

        2866

        xiangyu_16888:关于稳定转染的若干问题

        1 转染后24小时以1:10的稀释比例加入新鲜的含G418的培养基中,其目的是什么?

        2 此时换液是否将DNA-脂肢体复合物去处?

        3 加入G418的量是按体积加还是按细胞数加?

        4 转染后培养基除了G418是否也加入双抗?

        谢谢各位大虾了![color=red][/color]

        丁香园网友bigbang_0_0认为:

        1.利于两周后挑取单克隆.

        2.是.

        3.按体积加.

        4.是.

        丁香园网友capricornkey认为:

        1。G418是用于筛选单克隆的,若你转染的质粒上不含有Neomycin这段基因,那你需要共转染pcDNA3,然后进行G418筛选;至于比例的问题,应该先摸下G418细胞致死最大量,然后确定比例;

        2。脂质体一般都有毒性,长时间作用会使细胞损伤(尤其是Lipofenctine2000),所以要换液;

        3。如1所述,加时候算的话,按体积比较准确方便;

        4。加双抗是为了避免细胞污染,刚转染后的细胞不能加,因为脂质体-DNA进入细胞的同时,抗体也会进入,损伤细胞;一般建议不加!

        丁香园网友xiangyu_16888认为:

        capricornkey 你好:谢谢你,还有一个问题想请教您,

        悬浮培养的细胞即使死了也是悬浮着的,因此最大的问题就是怎么筛选?

        丁香园网友capricornkey认为:

        悬浮培养的细胞没有经验,确实有这个问题;

        我觉得是不是得加大筛选力度,于96孔板挑单克隆,观察其生长情况,可能工作量很大,或者流式进行分选

        纯属个人想象,没有做过~R~S~undefined

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