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        PCR-SSCP[PCR-single strand conformation polymorphism]

        互联网

        3002

        PCR是DNA的聚合酶链式反应,SSCP 是单链构象多态性。SSCP一般都要采用PCR扩增的方法进行检测,故名PCR-SSCP。此项技术的原理是,不同序列组成的单链DNA或RNA在非变性聚丙烯散胶凝胶中电泳,会因其空间构象不同表现出不同的迁移率。

        因此,可以将基因组中特定的DNA片段用PCR方法扩增,然后变性成为单链,在非变性聚丙烯酷胶凝胶中进行电泳,与对照的DNA片段进行比较,只要它们之间存在一个碱基的变异,就会表现出电泳行为的不同。

        显示不同PCR扩增片段电泳迁移率的方法,可采用漠化乙键染色或银染色,或用放射性同位素或荧光素标记在 PCR 引物上,然后进行检查,可提高分辨率。PCR-SSCP分析技术在检测与疾病有关的单个碱基突变、连锁分析等方面极其有用。

        在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾)。

        1、制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

        按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使 模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之凝固。然后拔掉梳子,顶部加入1×TBE封闭,备用。

        2、电泳

        取10μlPCR产物,加入10μl变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下 电泳。

        开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染。

        3、银染法

        将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min。用去离子水洗 二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min。用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色7min。最后,用0.75%NaCO3终止显色。

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