PCR-SSCP 技术实验

PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

一、PCR反应

20 ml反应体系成分如下：

模板DNA（100 ng/ml）         1 ml

10×PCR反应缓冲液                2 ml

Taq DNA聚合酶（5 U/ml）  0.2 ml

4×dNTPs（2.5 mmol/L）        1 ml

MTHFR上下游引物             各 1 ml

ddH2O 加至终体积               20 ml

PCR反应循环参数：

95℃ 5 min；

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30个循环；

72℃ 7 min。

反应结束后，置4℃保存。

二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1. 制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶：30%聚丙烯酰胺（交联度49:1）10 ml，5×TBE缓冲液10 ml，加蒸馏水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TBE），缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

2. 取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀，98℃变性10 min，迅速冰浴。

3. 取5 ml混合液加到点样孔中，以1——8 V/cm电泳4——5 h。

三、聚丙烯酰胺凝胶染色

1. 拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1——2遍。

2. 倒入固定液，固定8——10 min。

3. 用蒸馏水冲洗1——2遍；倒入银染液，银染10——12 min。

4. 用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。

5. 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。

四、结果判断

观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。

1. 靶DNA序列长度不宜过长，否则灵敏度下降。

2. DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16——18 cm以上。

3. 染色最好在塑料盘中进行。

4. 环境温度越高，聚丙烯酰胺凝胶越易凝固。应根据环境温度的变化调整

凝胶中10％过硫酸铵与TEMED的用量。

5. 电泳过程中应保持恒温，最好使用薄的凝胶和冷却系统以散发热量。

6. 用AgNO₃染色时，染色时间需随环境温度变化作适当调整，环境温度越

低，所需的染色时间越长。

7. 显色时间不可过长，以免背景过深影响结果观察。