胞质液的制备

一、网状细胞和红细胞胞质液的制备

1. 自动物身上采血，每 7 ml 血加 1 ml 酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液（ACD；75 mmol/L 柠檬酸三钠，38 mmol/L 柠檬酸，136 mmol/L 葡萄糖，pH 5.0)。

2. 室温 500 g 离心 10 分钟收集网状细胞和红细胞。吸出血浆和白细胞层。

3. 用 1~2 倍体积的 2% 明胶（Sigma) /PBS溶液（预热至 37℃）悬浮细胞，37℃ 水浴静置至少 30 分钟。

4. 吸出上层含血小板和白细胞部分，用 PBS 在 1600 g 离心清洗细胞，尽可能多的吸出上清。

5. 加入 2 倍体积的裂解缓冲液裂解细胞，冰浴 20 分钟。

裂解缓冲液：

0.75 mmol/L 乙酸镁

0.15 mmol/L EGTA

3 mmol/L DTT

蛋白酶抑制剂

6. 裂解液用超速离心机，4℃，100000 g 离心 30 分钟。

7. 收集上清，避免下层混浊的红细胞影部分。加入1/10 体积的 10x 转运缓冲液。

10x 转运缓冲液：

200 mmol/L HEPES，pH 7.3

1.1 mol/L 乙酸钾

20 mmol/L 乙酸镁

8. 分成小份装入微量离心管中，在液氮中冷冻，-80℃ 或液氮中保存。

二、用培养细胞制备胞质液

1. 500 g 离心 5 分钟收集细胞。

2. 用 PBS 在 500 g 离心 5 分钟清洗细胞两次。

3. 像网织红细胞的第 5 步那样，在冰上用 2 倍体积的裂解缓冲液中溶胀细胞 20 分钟。

4. 用一紧密吻合的金属或玻璃 Dounce 匀浆器研磨 10 次以裂解细胞。

5. 4℃，10000 g 离心 10 分钟去除细胞碎片。

6. 收集上清，按上面讲的网织红细胞的第 6 到 8 步那样处理。

三、用组织制备胞质液

1. 自新处死的动物中采集组织，用 PBS 清洗。

2. 用剃刀片将组织切成小碎块，与上文的裂解缓冲液一起加入预冷的 Dounce 匀浆器中。

3. 按上面的细胞操作步骤的 4~6 步那样处理。

四、用卵母细胞制备胞质液

1. 自麻醉的动物中取出卵巢，放入 PBS 中。

2. 去除粘连的其他组织，吸走多余的 PBS，放进预冷的 Dounce 匀浆器中。

3. 加入 1 倍体积的转运缓冲液，用松散吻合的研杵温和地研磨两次使之裂解。

10x 转运缓冲液：

200 mmoI/L HEPES，pH 7.3

1.1 mol/L 乙酸钾

20 mmol/L 乙酸镁

4. 4℃，2000 g 离心 10 分钟，用一巴斯德吸管移走上清。

5. 4℃，100000 g 离心 30 分钟，收集上清，仍然要注意不要碰上下两层。

6. 用转运缓冲液稀释，按上面说的方法冷冻。