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        实时荧光定量PCR

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        2790

        实时荧光定量PCR

        coolautumn

          在使用荧光进行PCR 定量时,荧光信号与产物模板数成一一对应的关系,检测荧光的信号就可以对PCR 产物定量。但是,在使用终点法测定的重复性并不好。由此PE公司于1996年发明了实时荧光定量PCR ,临测每个循环的荧光强度,并使用Ct值进行分析,很快得到大家的接受,广为应用。

          下图是PE公司在同一台PCR 仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。
         



        由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。我个人认为主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了,影响作用很复杂,而PCR 扩增产物是高浓度的,因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期,扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。

          同时,由上图我们也可以看出,在Ct值所在处重复性却惊人的好。Ct值,C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。而所设阈值都很低。还而言之,Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度,影响因素小,误差没被放大,所以具有良好的重现性。

          固定循环数后,荧光信号与模板数成正比,但当固定荧光信号值后,模板数就与循环数成反比。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值(如图2所示)。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。



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