实时荧光定量PCR

互联网2013-12-26

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实时荧光定量PCR

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　　在使用荧光进行PCR 定量时，荧光信号与产物模板数成一一对应的关系，检测荧光的信号就可以对PCR 产物定量。但是，在使用终点法测定的重复性并不好。由此PE公司于1996年发明了实时荧光定量PCR ，临测每个循环的荧光强度，并使用Ct值进行分析，很快得到大家的接受，广为应用。

　　下图是PE公司在同一台PCR 仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。
　

由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。我个人认为主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR 扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。

　　同时，由上图我们也可以看出，在Ct值所在处重复性却惊人的好。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。而所设阈值都很低。还而言之，Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性。

　　固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。