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        IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤

        互联网

        17848

        E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。

        材料

        1、诱导表达材料

        ( 1 ) LB (Luria―Bertani))培养基

        酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

        NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%

        蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

        适用范围:大肠杆菌

        ( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。

        ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:

        50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

        50 mmol / L DTT

        2 % SDS (电泳级)

        0.1 % 溴酚蓝

        10 % 甘油

        2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

        1 )酶溶法

        (1)裂解缓冲液:

        50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

        1 mmol / L EDTA

        100 mmol / LNaCI

        (2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。

        (3)10 mg / mL 溶菌酶。

        (4)脱氧胆酸。

        (5)1 mg / mL DNase I。

        [1] [2] 下一页

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