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        PCR 抑制物的来源与一般作用机制

        诺唯赞生物

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        样本想要成功转化成为 PCR 的结果,前期需要注意的步骤有很多,包括:样本的采集、运送、保存以及核酸提取,每一个步骤都需要小心翼翼,中间的过程可谓是困难重重。样本在转化成 PCR 结果的过程中,究竟是哪些因素导致转化过程如此艰难呢?下面由小编带着大家一起去扒一扒样本中影响 PCR 检测的抑制物。

        PCR 抑制物的来源与一般作用机制

        图 1. 核酸处理与检测流程图

        一、PCR 抑制物的来源

        PCR 抑制物的来源包括内源性与外源性两种

        1. 内源性

        天然存在标本中的组成成分。如:免疫球蛋白、蛋白酶、血红蛋白及其代谢产物、血红蛋白中的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。

        2. 外源性

        外部引入的抑制物。如:肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物

        二、PCR 抑制物一般作用机制

        PCR 抑制物中大部分的作用机制尚不完全清楚,但基本可以归为三类:

        1. 干扰核酸提取过程中的细胞裂解;

        2. 降解或包裹核酸;

        3. 热稳定 DNA 聚合酶失活。

        1. 干扰核酸提取过程中的细胞裂解

        细胞裂解,核酸释放使得核酸与酶作用产生扩增。如果细胞裂解不完全,核酸释放不完全,就不会产生扩增。常见的简单处理:煮沸,优点:省时,操作简单。缺点:煮沸释放的 DNA 有时不能完全与结构蛋白或 DNA 结合蛋白分离,从而出现扩增抑制作用。单独煮沸的方法会降低扩增敏感性。

        2. 热稳定 DNA 聚合酶失活

        腐殖化合物是环境样本中最常见的抑制物,其可能是通过对 Mg2+的螯合作用而抑制聚合酶活性。

        3. 降解或包裹核酸

        DNA 可因为一些物理、化学或酶等因素作用而出现降解,如贮存的扩增产物在扩增后电泳时,有时出现的条带模糊,就是因为 DNA 的降解所致。DNA 的一级结构不稳定,会因为水解、非酶甲基化、氧化损伤和酶降解等出现降解。

        细胞中存在核酸酶,如果核酸酶处理不干净,残留在纯化的核酸样本中,从而降解靶核酸。微生物如细菌产生的限制性内切酶也会是一个降解 DNA 的因素。有些细菌的 DNA 酶属于热稳定的核酸酶,在扩增中期可水解基因组和引物 DNA。

        核酸和引物也因为其不能与 DNA 聚合酶结合而出现不扩增。如蛋白质、多糖、细胞碎片、脂类等对 PCR 的抑制作用,很可能就是通过对 DNA 的物理包裹作用而使其不能与聚合酶接触。

        乳胶手套上滑石粉对 PCR 扩增影响可能会通过其对 DNA 的非特异结合作用进行的。因为 DNA 可结合至玻璃、二氧化硅等上,这也是采用硅吸附方法提取核酸的基本原理。

        了解完核酸抑制物之后,我们要如何减少这些抑制物对结果的影响呢?主要的技术就是核酸提取。核酸分为 DNA 和 RNA,将其从样本中提取出来,是进行 PCR 的前提。将复杂样本核酸提取纯化出来,其目的是:
        1. 去除 PCR 抑制物;
        2. 增加靶核酸浓度,使其能达到特定 PCR 的测定范围;
        3. 增加样本的均一性,以保证测定的精密度和重复性。

        参考文献:
        [1] 李金明,王静. 实时荧光 PCR 技术(第 2 版). 北京:科学出版社,2016:70 - 72
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