qPCR相关故事

qPCR 的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的 qPCR 实验，也看了很多的资料，包括 Nature protocol，AB 官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。

我在这里跟大家分享一下自己的经验，最常用、最普遍的相对定量方法就是 2^-△△Ct 法。

首先将一次实验的所有基因 Ct 值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因 Ct 值减去自身内参基因 Ct 值，得到的数就是 △Ct。换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）。

然后，将每一组样本每一个目的基因的 △Ct 都算好，整理进 Excel，用本次实验中待研究样本的 △Ct 减去对照组样本的 △Ct，并同时对所有结果取相反数（就是加一个负运算，正数就变成负数，负数就变成正数），该步运算得到的结果就是 -△△Ct。

最后，对 -△△Ct 进行 2 的幂运算，即 2^-△△Ct 就得出 Fold Change。但是，我想说的是 2^-△△Ct 得出的是 Fold Change，不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因 mRNA 的情况，同时还具有放大效应，所谓放大就是本来 A 基因的 -△△Ct 得到为 2，B 基因 -△△Ct 为 4，两者相差 2，经过 2 的幂运算之后，A 基因为 4，B 基因为 16，两者相差 12。

相对定量本身就存在放大的情况，若是再采取 2^-△△Ct 就只能说看看趋势而已了，所以我在这里给大家推荐 ABi 官方的一个分析方法，就是 log2R，就是 log2 为底对 R 求对数。当相对定量分析时，默认扩增效率 E 趋近或等于 100%，这时候 R 就是 2^-△△Ct，当然原本的 R 的公式我会在后面附上，感兴趣的朋友可以自己去推导。

所以，我用的方法就是只计算到 -△△Ct 这一步就够了，这样得到的数据就有了正值与负值，正值表示较对照组 mRNA 上调，负值表示较对照组 mRNA 下调，作出图来非常直观，一目了然，也没有放大效应，显著性分析较为靠谱。这种运算方法最关键的在于负号以及实验组和对照组要分清楚。要不就得到相反的结果。

附上 R 的完整公式： R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)，其中，E1：目的基因引物扩增效率；E2：内参基因引物扩增效率。△Ct1：实验组目的基因 Ct 值差。△Ct2：对照组目的基因 Ct 值差。 你观察这个公式时候就发现，当扩增效率 E 为 1（即 100%）时，该公式就等于 2^-△△Ct，这就是为什么会有 2^-△△Ct 方法的原因。ABi 官网里的一款商业软件能直接给出每次试验每对引物的扩增效率 E，能得到较为实际的 R 值，所以 ABi 的商业软件会对 R 进行 log2 的运算，进而得到直观的结果。

本文作者系丁香园站友 @kainwar3