低至单拷贝核酸 qPCR 方案

荧光定量 PCR 技术可以实现 RNA 的相对定量，广泛应用于分子生物学研究及疾病相关研究。QIAGEN QuantiNova PCR 系列可支持包括一步法、多重等多种 qPCR 应用；超快速的反应体系 30 min 即可完成实验及独特的颜色指示方案杜绝加样错误；LNA（锁核酸）技术加持增强引物或探针的灵敏度和特异性。

QIAGEN QuantiNova PCR 系统中，独特配方快速提高 qPCR 的反应速率，最快只需 10 s 即可完成退火及延伸步骤，30 min 即可完成实验过程。

出色的检测灵敏度，可对最低单拷贝靶标进行检测，并能兼容跨越至少 8 个数量级（10 fg-100 ng）起始模板量，更加稳定、精准地应用于各种定量 PCR 应用。

独特的颜色指示方案有效杜绝加样的错误

LNA 技术加持，使得 qPCR 具备高度灵敏性和特异性，LNA能够区分单核苷酸，以更短的序列达到较高的 Tm 值。因此，LNA 技术更适合用于 miRNA 的 qPCR 检测。由于 miRNA 的长度仅有 22 nt 左右，序列同源性高，且不同 miRNA 之间 GC 含量差异较大，因此对其进行特异性检测面临着诸多挑战，尤其是定量 PCR 检测。针对这些挑战，QIAGEN 的 miRCURY LNA PCR 系统基于 LNA 的更强的亲和力，实现了以更短的序列达到较高的 Tm 值，不仅保障检测的特异性，灵敏度也能得到显著提升。此外，在同一检测体系中检测多个靶标时，通过引入 LNA 针对不同靶标引物的 Tm 进行调节，保障不同 GC 含量的 miRNA 能够以较为均一的效率被扩增，从而提高 qPCR 检测结果的准确性。

以 miRNA 的实时定量步骤为例：

1. 使用无 RNase 水将每个样本的 RNA 模板稀释至 5 ng/μl。

2.参照以下表在冰上制备逆转录反应。混匀后放在冰上。

3. 42℃ 孵育 60 min。

4. 95℃ 孵育 5 min 以加热使逆转录酶失活。

5.立即冷却至 4℃。

6. 将逆转录反应放在冰上，直接进行实时 PCR。

注：如不打算立即使用，请将未稀释的 cDNA 在 2-8℃ 保存最多 4 天，或在-15℃—— -30℃保存最多 5 周。 

7. 向 10μl RT 反应中加入 590 μl 无 RNase 的水，将 cDNA 稀释 1:60。不建议储存 1:60 稀释的 cDNA。

8. 根据下表制备反应混合物。由于 PCR 反应的热启动，在反应设置或编程实时循环仪时，没有必要将样品保持在冰上。

染料的使用应注意：无需 ROX 染料的设备：Rotor-Gene^®、Bio-Rad^®CFX、Roche^®LightCycler^®480、Agilent^®Technologies Mx 仪器；低浓度 ROX 染料：Applied Biosystems 7500、ViiA 7 和 QuantStudio Real-Time PCR Systems；高浓度 ROX 染料：ABI PRISM 7000、Applied Biosystems 7300 和 7900、StepOne Real-Time PCR Systems。当使用需要高 ROX 染料浓度的仪器时，ROX 参考染料一次反应中使用 20x 浓缩溶液。对于需要低 ROX 染料浓度的仪器，使用 200x 浓度。

9. 充分混合反应物，将 10μl 加入 PCR 管或 PCR 板孔中，或将 20 μl 加入 Rotor-Disc 100 中。

注意：此时可以暂停实验。将反应物在 2℃-8°C 下避光保存 24 h。

10. 在室温下对试管或平板进行短暂离心。

11. 根据下表对实时循环仪进行设置。

注：数据采集应在退火/延伸步骤中进行。

12. 将 PCR 试管或平板放入实时循环仪中，启动循环程序。

13. 使用实时 PCR 仪器附带的软件进行初始数据分析，以获得原始 Cq 值（Cp 或 CT，取决于 PCR 仪器）。

1. miRCURY SYBR^®Green PCR Master Mix 和 ROX 参比染料也可以在 2℃-8ºC 避光保存长达 12 个月。

2. 对于高表达的 miRNA，可以使用低至 10pg 的总 RNA 作为起始量。对于弱表达的 miRNA，建议使用高达 200 ng 的总 RNA。

3. 在冰上解冻 RNA 和 5x miRCURY RT SYBR 绿色反应缓冲液。室温下解冻不含 RNase 的水。

4. 用离心机收集引物管等侧面的残余液体，然后在冰上保存。

5. 在进行反转录操作时，应在冰上加样，以最大限度地降低 RNA 降解的风险。

内容来源： QIAGEN 凯杰