DNA重组

一）酶切实验　　本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。 　　【原理】 　　λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDN ...

一）酶切实验　　本实验学习用限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）EcoRI 切割λDNA及质粒pBR322DNA，琼脂糖凝胶电泳后观察酶切结果。 　　【原理】 　　λDNA 是大肠杆菌的一种温和噬菌体DNA，双股线状，分子大小为48.5 kb。 EcoRI酶可识别DNA中 G↓AATTC核苷酸序列，并在箭头处将其切开。λDNA含有5个EcoRI酶识别位点，可将λDN ...

（一）碱变性法提取质粒DNA 　　质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。　　分离和纯化质粒DNA的方法很多但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的 ...

（一）碱变性法提取质粒DNA 　　质粒(Plasmid) 是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。　　分离和纯化质粒DNA的方法很多但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增，细菌菌体的 ...

载体主要有病毒和非病毒两大类其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly（ ...

载体主要有病毒和非病毒两大类其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly（ ...

一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的 ...

制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌 试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30 ...

一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠( ...

制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌 试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30 ...

一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠( ...

所周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大难题，一下是本人在试验过程中收集的海藻DNA制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。一、可大量培养的海洋细菌1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和 ...

所周知，海藻由于富含多糖，DNA提取是一大难题，一下是本人在试验过程中收集的海藻DNA制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。一、可大量培养的海洋细菌1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的EP管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃Tirs饱和酚200μl和 ...

一、实验目的与原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。二、材料以方法1、 材料：培养菌体2、 仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高 ...

一、实验目的与原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织，通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。二、材料以方法1、 材料：培养菌体2、 仪器设备：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，高 ...

一、目的与原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR ⅠHind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作，掌握内切酶的实验操作技术。二、材料与试剂1．材料：λDNA2．仪器：离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪3．试剂EcoRI及缓冲液，HindIII及缓冲液，λDNAT ...

一、目的与原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR ⅠHind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作，掌握内切酶的实验操作技术。二、材料与试剂1．材料：λDNA2．仪器：离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪3．试剂EcoRI及缓冲液，HindIII及缓冲液，λDNAT ...

一、目的与原理DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。二、材料和方法1． 仪器离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器2 ...

一、目的与原理DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作，掌握这一DNA片段的连接技术。二、材料和方法1． 仪器离心机，恒温设备，真空干燥机，取液器2 ...

一、目的与原理当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。二、材料和方法1． 材料：大肠杆菌2． 仪器：离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜3． 试剂LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴TFB：10Mm MES（pH6. ...