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        染色体DNA的提取

        互联网

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        一、实验目的与原理
        DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。本实验通过植物样品在液氮下研磨以粉碎组织,通过裂解液裂解细胞,有机溶剂反复抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开,在RNase作用下,降解RNA以纯化DNA。
        二、材料以方法
        1、 材料:培养菌体
        2、 仪器设备:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,高速冷冻离心机,台式离心机,移液枪一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪
        3、 试剂:
        细胞裂解液 100 mM Tris-HCl
        5 mM EDTA
        500 mM NaCl
        1.25% SDS
        PH 7.5
        饱和酚,氯仿/异戊醇,酚/氯仿/异戊醇
        无水乙醇,70%乙醇,异丙醇
        3 M NaAc pH5.2, RNase,50×TE缓冲液,电泳载样缓冲液
        三、操作步骤
        (1) 培养菌体
        (2) 加入10 ml裂解液,1/10体积酚,于65℃下20-30 min,然后加入等体积的氯仿,轻摇
        (3) 12000-15000rpm离心15 min
        (4) 取上�液,加入等体积氯仿,轻摇,12000-15000rpm离心15 min
        (5) 取上�液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)
        (6) 加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2),置于室温下10 min
        (7) 12000-15000rpm离心10 min
        (8) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀
        (9) 加入2倍体积无水乙醇
        (10) 12000-15000rpm离心10 min
        (11) 倒弃液体留下沉淀,真空干燥
        (12) 复溶于2 ml TE
        (13) 加入RNase,65℃或37℃处理10-30 min
        (14) 加等体积酚,酚/氯仿,氯仿各一次,12000-15000rpm离心10 min
        (15) 取上�液,加入0.6倍体积冷异丙醇(-20℃)或2倍体积冷无水乙醇(-20℃)
        (16) 加入1/10体积的3 M NaAc(PH5.2),置于室温下10 min
        (17) 12000-15000rpm离心10 min
        (18) 倒弃液体留下沉淀,用70%乙醇洗涤沉淀
        (19) 真空干燥沉淀
        (20) 复溶于0.5-1.0 ml的TE或水中,分装成小体积,4℃或-20℃保存。
        (21) 电泳检测提取DNA的质量
        四、结果与分析
        点样空,若发亮则说明有污染
        超螺旋结构DNA,若条带有拖尾则
        说明有破碎的DNA
        少量未清除的RNA
        五、注意事项
        1、 重点防止DNA的损伤,包括各种物理、化学和机械损伤。
        2、 干燥好的染色体DNA最好溶于去离子水,以备后面直接利用。如果用TE 缓冲液溶解,后面还需去离子。
        3、 取上清时,如果上清液过少,可再加入少量水,重新离心,取上清,避免DNA损失过多。

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