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        DNA片段的连接技术

        互联网

        1327

        一、目的与原理
        DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键,这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化,但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作,掌握这一DNA片段的连接技术。
        二、材料和方法
        1. 仪器
        离心机,恒温设备,真空干燥机,取液器
        2. 试剂
        T4DNA连接酶,10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚,TE缓冲液,电泳缓冲液、3M NaAc
        三、操作步骤
        取干净、灭菌新Eppendorf管,按下表加入各试液
        试液 体积(μl)
        T4DNA连接酶缓冲液 1.5
        λDNA 10
        ATP 1
        无菌水 1.5
        连接酶 1
        总体积 15
        19--20℃ 保温2小时,提取已连接好的DNA片段。电泳分析。
        四、结果 (略)
        五、注意事项
        1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃,但该温度下DNA退火效率低,连接效率还不如22℃高。
        2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。

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