受体菌感受态细胞的制备

一、目的与原理
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。
二、材料和方法
1． 材料：大肠杆菌
2． 仪器：
离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
3． 试剂
LB培养基，0.1M MgCl2，3mM氯化六氮合高钴
TFB：10Mm MES（pH6.3）
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步骤
大肠杆菌在LB培养基平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌到对数期。取1ml培养物7000rpm，离心3min，收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体，冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙（或TFB），放置于冰浴，即得感受态细胞，此细胞可现用，也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中，投入液氮，然后储于-70℃保存。
四、结果 （略）
五、注意事项
一般地，新制备的感受态细胞48h后转化效率降低，15d后失效。因此，感受态细胞不能保存太久，4℃保存一周，但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔，损伤感受态细胞。