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        亚克隆技术

        互联网

        1739

        一、目的与原理
        限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作,掌握内切酶的实验操作技术。
        二、材料与试剂
        1.材料:λDNA
        2.仪器:
        离心机,恒温水浴,取液器,电泳仪,电泳槽,紫外观测仪
        3.试剂
        EcoRI及缓冲液,HindIII及缓冲液,λDNA,TAE缓冲液
        三、操作步骤:
        EcoRI、HindIII单酶切及部分酶切
        取2只干净、灭菌新Eppendorf管,分别按下表加入
        试剂 A(μl)
        灭菌水 0
        10×缓冲液 2
        质粒 5
        染色体DNA 12
        EcoR I
        1
        HindIII
        0
        总体积 20
        37℃保温1―2小时。保温结束后,分别加入0.5M(pH8.0)EDTA(使终浓度达到10mM)。加入6μl电泳加样缓冲液。
        电泳。
        EcoRI、HindIII双酶切
        取1只干净、灭菌新Eppendorf管,按下表
        加入试剂 体积(μl)
        灭菌水 14
        10×缓冲液 2
        λDNA 2
        EcoR I
        1
        HindIII
        1
        总体积 20
        37℃保温1―2小时。保温结束后,分别加入0.5M( pH7.2)EDTA(使终浓度达到10mM)。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。
        四、结果 (略)
        五、注意事项
        1、 酶的量不超过总体积的1�,以为酶的保存液中含有甘油,甘油太多会形成星活性,切下非目的片段。
        2、 在加入模板DNA以前可加入少量BSA,减轻管壁对酶的吸附作用。
        3、   如果用双酶切,必须注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可以用同种缓冲液,则可同时水解,否则低盐浓度的限制酶必须先用,随着调节盐浓度,再用高盐浓度的限制酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿(1:1)抽提,加0.1倍体积的3mol/LnaAc和2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃放置30分钟,离心,干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。


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