质粒

质粒提取的原理因为觉得对新人很重要，所以再转贴一次。碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多 ...

这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种；有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说，但是熟能 ...

非常感谢lewis 1121！！！另外在论坛中找到部分关于滤纸上质粒溶解提纯保存的方法，贴在这里，供同道参考。（没有进行系统整理，也未按原发贴顺序，详情还请见原文）请问：如何从滤纸上洗涤下质粒DNA？(dxyshining )我是这样做的,加入PH8.0 TE,边加边用枪尖压实滤纸,直至确认能吸出一点液体,然后用这液体去做转化.记住要留出点呵.滤纸也不要马上扔掉. (楚风)4度下TE浸泡过夜,次日即可使用....(roger )１。滤纸有质粒部 ...

目的:构建目的基因的真核表达载体 历时整整一学期,期间经历了很多挫折,遇到很多问题,也从中学到很多经验.借寒假的时间写了写我一学期构建的经历,把我的一点经验拿出来和大家分享讨论.分步来说:一.PCR扩增得到目的片段1.引物的设计与合成:这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基） ，后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次 ...

本人整理了论坛上关于战友所求助的各种质粒载体的图谱，后面所跟着的网站都是含有前面名称载体的详细图谱，希望对大家能有帮助！质粒pGEM-4Z载体图谱 http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/5198013_0.htmlpGEX-4T-2载体图谱：http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/4211077_0.htmlpGEX-4T-1载体图谱：htt ...

我5月18号向一位韩国Han-Yang大学的教授索要两个基因的质粒。得住于我们园子里面很多贴子的帮助，在他们的帖子的帮助下，今天（6月2号）老外终于把质粒寄来了。前后仅仅半个月和老外的接触，让我深刻体会到国外专家教授的那种科学无私的精神。把与他来往通信贴出来，供以后需要的朋友参考。也宣传一下这位教授（Sang-Hun Lee MD.PhD）的科学无私精神。Sent: Sunday, May 18, 2008 12:34 PMDear Dr Lee,I am wor ...

1.原理和方法总则操作指南质粒的简单提取特殊类型质粒提取酵母质粒提取 基因疫苗质粒提取 双歧杆菌质粒提取 重组质粒的提取2.质粒的保存与运输质粒的保存低浓度质粒的保存滤纸上质粒的溶解3.试剂与试剂盒Promega的Wizard试剂盒Promega试剂盒效果谈4.经验之谈质粒提取的一点经验 提取失败请注意关于低拷贝质粒简便的质粒提取方法振荡的手法为什么会出现沉淀一篇关于质粒提取的好文章大提质粒经验谈5.质粒的酶切

按一下步骤操作，连续两次均抽不出任何东西，请高手指点！抽提用作转染的重组质粒DNA(用5ml菌液)所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。具体操作步骤如下：（1） 将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。（2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬 ...

随着核酸疫苗和基因治疗的迅速发展，高纯度的，符合药物动力学的质粒DNA的需求越来越大，本人准备的论文综述初稿，对目前大规模进行质粒DNA生产的流程有一些初步见解，与大家一起探讨。======================================================综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展一、质粒DNA细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种 ...

晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system（pET系列质粒）的发明者。T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了 ...

复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享：从质粒抽提谈起碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研 ...

总结一下最近构建质粒的心得，最近构建这个质粒已经有2个月了，一直没成功，到最近才有点眉目，只等测序了。其实质粒构建很容易，但有时候就是得不到结果，对于大片段（》3kb）要克隆到载体里，还是有难度的。首先介绍一下背景，我的质粒是pcDNA3.1+,片段是4371bp，刚开始我是用cDNA跑PCR，用的是高保真的酶，PCR产物也很完美，浓度也不低，用的是NotI单酶切，然后把质粒去磷酸化后再做连接，在百度上搜索到有人介绍说 ...

第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节 概 述　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达 ...

到医院实习之前，我有幸跟随我的恩师，利用课余时间做了两年多的基础科研。从不懂规矩到渐入佳境，期间学习了很多东西，在此感谢我的恩师！我们是生物化学教研室，这两年的时间里我做了很多生化方面的实验。像细菌培养、细胞培养、PCR、western-blot、MTT测细胞增殖能力，这些实验都有商品化的试剂和推荐的操作方法，做起来，难度并不大。唯独让我感到苦恼的就是ShRNA表达质粒的构建这部分，它耗费了我们很多的精力，虽然最终 ...

重组质粒一月有余，颇有心得，与各位战友分享如下：1：关于双酶切的Buffer，一直是酶切的重点。有人喜欢A酶切完回收再B酶切，其实可以通过NEB网站上查询大部分双酶共切的Buffer问题，常见的双酶搭配甚至可以找一本TAKARA或者其他公司的Catalog，内切酶部分在前面肯定就有双酶切的Buffer推荐表。有些酶没有搭配的推荐，但是有各种酶在L，M，H，K及T+BSA的相对活性，AB两酶选一个合适的即可。注意尤 ...

本人持有以下载体及基因：（原则上只交换不赠送，欢迎广大站友互通有无）QQ 2283524599 luckamily@126.com一、载体1)、miRNA载体Promega miRNA靶标克隆载体 psiCHECK-2 psiCHECK2 ampAmbion miRNA靶标克隆载体 pmiR-report pmiRreport ampInvitrogen miRNA过表达载体 PCDNA TM 6.2-GW/EmGFP-miR2)、哺乳动物/真核表达载体pcDNA3.1+ 不 ...

从质粒抽提谈起复旦大学生化与分子生物学实验室碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至 ...

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...

这段时间在作实验,这篇文章我觉得特别好,现在拿出来和大家分享一下!从质粒抽提谈起碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。每个曾经用碱法抽提过质粒朋友，希望你看本文后能有所收获。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先 ...

我以前做的实验都是通过感受态的转化方法来转化枯草芽孢杆菌的。但是枯草芽孢杆菌的感受态转化效率比较低。最近我采用电转化的方法，但是遇到了一个问题：就是每次电击完毕后，加入复苏缓冲液37度复苏2h后，发现原来还混混的转化液竟然变得澄清了！涂布后一个转化子都没有！不知道是怎么回事？还有：垂悬菌体必须要温柔吗？我挺用力的，但不至于一个转化子都没有吧？质粒样品里面的RNA很多有没有影响啊？我的质粒RNA蛮多的。质粒加多了 ...