收到lewis 1121的质粒，谢谢（内附滤纸质粒溶解提纯保存的方法）

非常感谢lewis 1121！！！

另外在论坛中找到部分关于滤纸上质粒溶解提纯保存的方法，贴在这里，供同道参考。（没有进行系统整理，也未按原发贴顺序，详情还请见原文）

请问：如何从滤纸上洗涤下质粒DNA？(dxyshining )

我是这样做的,加入PH8.0 TE,边加边用枪尖压实滤纸,直至确认能吸出一点液体,然后用这液体去做转化.记住要留出点呵.滤纸也不要马上扔掉. (楚风)

4度下TE浸泡过夜,次日即可使用....(roger )

１。滤纸有质粒部分剪下，加入少量纯水，浸泡。

２。高速离心，吸出上清。

３。用离心上清转化感受态细菌。(eeflying)

看质粒浓度，一般可以取十分之一左右的量转化，其余的冻存备用。(yong)

（多长时间可溶于水）质粒是速溶的，有３０分钟怎么也够了。（eeflying）

大家好！ 我从一位学者那要了一个质粒（在滤纸上），只有1-2微克（我准备先用一半），浓度未知；我做转化需要100ngDNA, 且其体积要求小于10微升（我打算用不超过4微升），这意味着从滤纸上溶解下的质粒浓度应大于是25ng/微升，故只能用小于40微升的纯水来溶解滤纸上的质粒；这连纸都不会湿！更不用说用分光光度计测浓度了。是否应先用稍多点的水溶解，测浓度后，再用乙醇来浓缩吗？滤纸可直接取出吗？(dengjunhui )

用已醇再沉淀，损失一般较大，建议你先电击转化后挑单克隆再提取质粒！(tigertang )

一般来讲，对于从别人那里获得的质粒应该进行以下操作：

【1】溶解质粒：根据质粒的多少，一般终浓度为50ng/ul；

【2】转化：应使用适当的宿主菌，如无特殊说明，使用DH5alpha；感受态的效率一定要高，制备方法可以在论坛内检索；

【3】筛选：涂板时注意抗性，L棒在平板上沿半径缓慢、匀速旋转一周，切忌反复涂；

【4】鉴定：小提质粒，根据图谱进行相应的酶切鉴定，必要时测序；

【5】质粒保存：大量制备已经证实的质粒，检测纯度，用TE溶解分装，同时应使用无水乙醇充分混悬一定量的质粒并分装，－80度保存；

【6】菌种保存：将过夜培养物与等量甘油充分混匀、分装，－80度保存；取适量菌液冻干，－80度保存。(liven)

很有启发，但有两个问题没搞明白：

1：【5】中同时应使用无水乙醇充分混悬一定量的质粒并分装 有何目的？用TE溶解分装－80度保存不就可以了吗？

2： 【6】中取适量菌液冻干，－80度保存。好像分子克隆等书这种方法好像没有提过，能详细解释一下好吗？

另外在用转化液（200ul;）涂布抗生素平板时生长菌落过密，不好挑选单菌落。请教这个问题除了用少量转化液（50ul;）涂布外，可否用画线法分离单菌落？ (money )

使用无水乙醇充分混悬一定量的质粒并分装 ，此时质粒在室温可以放置3个月以上。这样做可以认为是质粒的永久保存。冻干菌种置－80度保存可以认为是菌种的永久保存。
涂板时L棒在平板上沿半径缓慢、匀速旋转一周，就像秒针一样，这样菌落密度就逐渐降低。当然了，在转化率非常高的情况下，划线法也可以用。 (liven)

少用点水。多溶一会儿，吸取时拼命挤出一些就够了（除非质粒浓度太低），涂板时你可以涂一部分（1/5~1/3）到平板上，剩下的涂到另一个平板上，不就是两个梯度了吗？ (biowind)

1）先用别的质粒验证感受态

2）用尽可能少（但一定要彻底泡湿）的TE浸泡

3）延长热休克后的温浴时间至2hr

4）取一半，离心浓缩，涂板

5）剩下的接种试管，选择培养基液体培养过夜，划线分离单菌落 (Yong)

如不立即使用该怎样保存？

放到合适体积的TE里－70冻起来（hepatitis ）

可以直接把滤纸放在-20或-70的冰箱中，或者取一部分溶于TE中保存。个人推荐直接保存不溶解。要注意密封。 （kras）

与其直接保存，还不如赶快把它洗下来，然后转到载体菌中，一是重新提取质粒、鉴定正确后，冻干保存；二是保存转有质粒的细菌，甘油管、冻干管、穿刺管。这样做保险。呵呵！你以为呢？ （nothing）

一定要先转化、鉴定，大量提取质粒，质粒和菌种冻存同时进行。质粒用无水乙醇冻存。 （liven）