• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        Promega试剂盒抽提质粒遇到困难,紧急求教高手!

        丁香园论坛

        2019
        按一下步骤操作,连续两次均抽不出任何东西,请高手指点!
        抽提用作转染的重组质粒DNA(用5ml菌液)
        所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System,能够去除对细胞有害的细菌内毒素。具体操作步骤如下:
        (1) 将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。弃上清,将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。
        (2)加入250µl 重悬液,振荡至完全重悬。
        (3)加入250µl细胞溶解液,颠倒离心管6~8次,彻底混匀。室温孵育5min。
        (4)加入350µl中和液,立即颠倒离心管6~8次,彻底混匀。
        (5)室温下10000×g离心细菌溶解产物20min,上清移至新的1.5 ml 离心管,再次离心20 min,将上清移至新离心管。
        (6)彻底摇匀除内毒素树脂,加50µl到离心管中,室温孵育10 min,在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。
        (7)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清,颠倒磁珠分离架和离心管,去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec,吸取上清至新离心管,弃去沉淀。
        (8)加入200 µl GTC(5M/L),与上步分离的上清剧烈振荡混和。如果GTC产生沉淀,37℃加温10min,冷却到25℃使用。
        (9)彻底重悬磁珠,加150 µl至溶液中,剧烈振荡混和,室温孵育2~3 min。
        (10)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清,颠倒磁珠分离架和离心管,去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec,弃上清,离心管继续放置2~3min,去除剩余液体。
        (11)将离心管从磁架上取出,加入200 µl 4/40洗脱液。剧烈振荡15sec 重悬磁珠微粒。4/40洗脱液可以去除无关蛋白,如核酸酶。
        (12)将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清,颠倒磁珠分离架和离心管,去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec,弃上清,离心管继续放置2~3min,去除剩余液体。
        (13)将离心管从磁架上取出,加入1.0 ml 80%乙醇洗涤微粒。剧烈振荡10sec,将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清,颠倒磁珠分离架和离心管,去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置至液体澄清后30 sec,弃上清,离心管继续放置2~3min,去除剩余液体。
        (14)重复操作步骤(13)两次。
        (15)洗涤完最后一遍后,打开离心管盖,放置在磁珠分离架10min,去除残余液体。
        (16)将离心管从磁架上取出,加入240 µl 去离子水,振荡10sec,在室温孵育1min。将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清,颠倒磁珠分离架和离心管,去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。放置3 min后,将上清小心移至新离心管中。14000g离心10min,上清移至新管中,同时计算上清体积。
        (17)加入0.5体积醋酸铵(7.5M/L)和2.5体积95%乙醇,混匀后室温下14000×g离心15 min。小心吸出上清,用1ml 70%乙醇洗涤沉淀,室温下14000×g离心5 min。小心吸去上清,空气中干燥5 min,用30 µl去离子水溶解。
        (18)分别取1ul,2ul,3ul反应产物电泳,估计质粒浓度。
        (19)用分光光度计测OD值及核酸浓度。
        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序