质粒

winniw214 小提的质粒（自己配的S1、S2和S3，不是试剂盒，但是师姐用过没问题的）结果质粒浓度很低。菌液是37度，250rpm摇了11h的，应该够浓。想问一下有没有什么改进的方法？另外，关于加过S1、S2和S3之后的操作（剧烈混匀、颠倒……），我查过问过有好多不同的说法。不知道亲们平时怎么做的，哪种效果比较好？谢谢qijilaile s1,s2,s3混匀后，上下颠倒几次，不宜太剧烈hualala321 手法是最重要的，溶液1 ...

寒凉 我最近要做E-cadherin DNA质粒转染HK-2细胞，想请教高手们在哪可以买到相关的质粒和使用何种转染试剂较好，谢谢！zhujoker 转染效率主要取决于你的细胞，转染试剂只是一个次要的方面，如果你的时间来得及，最好建议你使用慢病毒载体进行过表达，这样花的时间不是很多，效果肯定比转染好，至于质粒很多公司都有卖的。寒凉 谢谢您的指导本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以 ...

xxzjcg 请教构建载体，插于片段670bp，pcDNA3.1质粒5400bp，如果10ul连接体系，插于片段加多少？pcDNA3.1加多少？woxingwosu pcDNA3.1：片段约为1：3至1：4，其他的成分按照要求来做。xxzjcg 可是我做了1：4加的，长出几个菌，但菌落PCR是阴性的，请教可能什么原因cixinkejian 确认下你的酶切位点；直接克隆虽然省事，但是还不如先走T载体克隆，然后再连接到你的目的载体上了！r ...

云忆香香 最近分配到一个课题，但是刚开始学习，不知怎么做，请各位给点提示，谢谢！课题大致意思：已知一个质粒的目的基因序列，却不知道质粒序列，导师要求测出质粒的序列，有提示用染色体步移的方法。Ps：1，这个质粒很大，估计又20-30kb；2，目前市场上有测未知序列的试剂盒，但是最多测到3kb，我不知道用什么办法使其连续测下去；3，我的酶切位点都不知道；谢谢各位支持~zjubell 这么小的基因组，用高通量测序，很容易搞定的。20K ...

2425611 刚刚开始做实验 请教一个关于质粒比较基础的问题，质粒转染细胞后，是同细胞内的基因相融合后表达还是仍以质粒的环形形式存在表达？每个转染细胞内转染进入的质粒数量是怎么样的啊？这个数量和蛋白表达多少有没有关系？还有个问题是请问现在最常用的质粒转染技术是什么？菜鸟级的问题，请大家积极帮忙，多谢！！wanadoo 两种转染。 酶切，基因相融合。非酶切，环形形式存在表达。我用lipofedaminwoxingwosu 2425 ...

ono1180 求助各位同道：我想过表达一个基因，想选用一个质粒载体连接此基因再转染入细胞，选用的载体需要有绿色荧光标记，而且能筛选出稳定转染的细胞系，上网查了一下觉得pEGFP系列的好像符合我的要求。请问这个载体怎么样，大家还有什么载体觉得挺好，请指教，感谢了。xiaokangkuaile 我用的是pEGFP-C1表达载体，但我的目的基因对GFP表达有影响，转染效果很差xiaokangkuaile 现在正在做其他的目的 ...

real_madrid_146 有个选择性剪接的问题不是很懂，想请教下大家一个完整的mRNA个外显子，起始密码子在第一个外显子，终止密码子在第十一个外显子。第二个外显子选择性剪切缺失之后，随后的序列发生移码，终止密码子出现在第三个外显子了，那后面4-11个外显子还能翻译不？有没有可能后面的外显子内重新出现个起始密码子，也同样翻译？类似于原核生物的多顺反子那样。因为在genebank上可以查询到相应的序列，里面标注的 ...

brucewu1986 我挑的阳性克隆（已检测），在加有抗生素的摇瓶中培养后，放在4度冰箱一天，枪头蘸取少量，6ml加相应抗生素管摇过夜，菌液浑浊，kit小提，测浓度约150ng/ul,但电泳检测看不到条带，酶切电泳也看不到，会不会是质粒丢失？但为啥可以在抗生素的培养基中生长？目的片段2.5kb，载体6k各位战友有没有遇到这种情况woxingwosu 我觉得一般情况下，质粒丢失的几率比较低。你是怎么检测阳性克隆的呢？如果是菌 ...

riset 看了一些文献，常用的荧光素酶质粒是pGL3，但是这个质粒图谱上，荧光素酶下游只有一个XbaI的酶切位点，不是多克隆位点，请问是如何解决克隆片段顺序问题的。谢谢。shilei5794749 用你序列的特异上游引物和RVprimer4，正向连进去菌P能扩出条带；反向连进去的扩不出条带。riset 多谢指教，另外再问下，UTR一般都比较长，不能全部克隆,一般克隆多长合适呢？还有就是PCR扩增UTR的时候是以基因组为模 ...

tianjiaoya 小弟最近要构建一个质粒，需要用到Gal4转录因子，有哪位大侠知道Gal4的UAS在那个质粒上？最好是容易买到的质粒啊，我查了好多质粒，都很难买到。或者能把Gal4的UAS的序列告诉我，这个上游激活序列应该不大，我可以去直接人工合成，然后参照别人那些构建成功的质粒的样子，把UAS插入到我的质粒中去，谢谢各位大侠了！！！song333 GAL4/UAS systemThe GAL4-UAS ectopic expres ...

baiguo861029 各位前辈好 本人是个新手，听很多师兄师姐说丁香园很好，这儿的人都很热情帮助他人。我现在研究生在读，因为课题需要，急需购买这个质粒pBV889，试了好多方法都没找到。这个质粒含有人干扰素alpha-2b编码序列，即cDNA序列。非常希望知道的前辈给予我帮助，非常感谢！！woxingwosu 用google搜索了一下，发现很多文章都有，国内发表的也很多。其实你或者你老板可以写信去要一下就方便多了，还不用 ...

陆军鱼 小弟通过转化感受态扩增pGL-3 Basic、control，pRL-SV40三种购买来的质粒，小提后电泳检验一下扩增的成果，结果让我不太理解，为什么质粒大条带后面还有“杂带”呢？12道，34道，56道都是从一块板上挑的两个单克隆，两个道的质粒在相应的位置都有杂带感受态经抗生素板检验没有污染不知道这样的杂带怎么解释？woxingwosu 这个可能是正常的吧（除了3和4有点怪怪的以外，建议再重新跑胶或者重新提质粒看看） ...

lsdcfhyj 用双荧光素酶报告基因检测系统进行报告基因检测时需要共转染两种荧光素酶报告基因质粒，但是我不知道两种质粒间的比例是多少，有哪位前辈做过这方面实验的，请帮我指点一下，谢谢了xxshc 这个比例没有特别的规定。我用的pRL－TK（海蜃素荧光素酶）的荧光值要高一些，我转20ng/孔（24孔板），作为内参.pGL3（萤火虫荧光素酶）的荧光值低一些，我转0.4ug/孔（24孔板）然后0.4ug的调整质粒。这样的话，萤火虫荧 ...

lsdcfhyj 向大家请教关于双荧光素酶报告基因检测系统与单荧光素酶报告基因检测系统的问题，两者的区别我基本清楚了，只是我没弄清楚用于检测的细胞究竟是应该同时转染两种质粒（分别含虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶报告基因）呢还是只需一个质粒上面同时含两种荧光素酶报告基因？还有一个问题是如果是要转染两种质粒的话，是只需在含虫荧光素酶基因质粒中插入所要检测的调控元件基因，还是两种质粒中的荧光素酶基因前都要插入调 ...

hhyy601 别人赠予基因腺病毒质粒，邮寄过来的，拿到后，我该怎么办？多谢！freecell 版内以前有讨论的。如果是点在滤纸上的，将滤纸减碎，然后浸泡在TE溶液中若干时间。随后低速离心，取上清。用滤膜过滤。将消毒的TE溶液转化相应宿主菌扩增即可。whbf5 转化DH5a或者jm109这一类的菌中保种和扩增本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：sh ...

longgyin8341 我想研究细胞在氧化应激损伤过程中核受体NFkB对于下游一些目的基因（如ICAM-1等）转录调控的影响，是不是需要把NFkB在基因组上的特异性结合元件克隆出来，与虫荧光素酶报告基因质粒构建重组质粒，然后转染细胞？若是如此：NFkb由于可以调控多种下游基因的表达，它在基因组上每个调控基因的结合序列都是特异的吗？或者说这段序列是固定的吗？如何在网上找呢？谢谢longgyin8341 继续求助中。。。 ...

longgyin8341 最近想做虫荧光素酶报告基因，但是从来没有做过，想求院子里高手指教：我是要观察一种药物是否能作用于细胞内的几种核受体（NFkB，PPAR，ER（目前还不清楚究竟是哪个，需要分别试验））的启动子区域，影响这几个核受体的转录水平，从而影响细胞的一些功能（比如凋亡等）。计划将这三种核受体的启动子区域分别扩增出来，然后与虫荧光素酶（或其他报告基因）构建重组质粒。再分别转染细胞，加入药物处理，观察荧光素酶的 ...

polo6892 请问哪个实验室的同学或是老师有Notch1质粒，有点朋友请和我联系下好吗？有事情咨询！多谢！我的EMAIL ：zhouwei5352877@163.com,QQ 286358161,我是武汉大学人民医院实验室的研究生！谢谢！liudaifu1997 我也感兴趣，等qinvicky 我们实验室做基因转染的，一直用N2质粒，不过我懂得不是很多~不知能否帮得上你kevinddd 我也需要啊！polo5352877 谢谢，你能把你 ...

xhrg 大家有谁用过pIVEX2.3d或2.4d等用于体外表达的质粒呀，有什么心得freecell 你想知道哪些方面的心得呢？xhrg 还可用什么质粒呢？本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

西点6688 请教一下各位大虾：质粒pACYC184和pBRM-Wt的具体结构是怎样的呢，谢谢！slytjiaofei http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector.html自己查查吧！！！lastone9853 这两个质粒pACYC184和pBRM-Wt的图谱，序列等可以在网上查到，我这有这两个载体，可以快递给你。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实 ...