【求助】问下荧光素酶pGL3上构建3‘UTR的问题

看了一些文献，常用的荧光素酶质粒是pGL3，但是这个质粒图谱上，荧光素酶下游只有一个XbaI的酶切位点，不是多克隆位点，请问是如何解决克隆片段顺序问题的。谢谢。

用你序列的特异上游引物和RVprimer4，正向连进去菌P能扩出条带；反向连进去的扩不出条带。

多谢指教，另外再问下，UTR一般都比较长，不能全部克隆,一般克隆多长合适呢？还有就是PCR扩增UTR的时候是以基因组为模板还是以总RNA逆转录后生成的cDNA为模板呢？

谢谢

有礼了，呵呵！

克隆UTR，那看你估计的cis-element在哪一块，另外参考EST信息和物种间保守性。好像没有统一定论吧，一般3K以下我就全搞下来。

以cDNA还是基因组为模版？这个看你UTR的已知结构以及你想获得的信息多少啦。我的意思是都可以，如果你的基因内没有URT introns的话（UTR introns有时候会有调控序列或者antisense RNA转录，你做报告基因如果兴趣不在这方面，那就无所谓），可以用基因组DNA扩。有些长的UTR，GC含量低，有复杂的二级结构，高保真酶很难扩，这样就买个BAC当模板也行。

这样啊，那你用的那家公司的PCR扩增试剂呢？

可以在插入片段的下游找一个酶切位点，通过酶切释放的长度来判断