酶学实验技术

问：我要配不同浓度的胰蛋白酶加到细胞里面观察MTT值，请问用什么浓液配啊？可不可以用完培，我怕里面的血清会影响胰蛋白酶的作用。请各位前辈指点，谢谢！ 答：血清肯定会影响胰酶的作用啊。不可以用无血清的培养基吗？ ...

问：小弟要做蛋白酶体抑制剂筛选相关的工作，在dxy上看了前辈的不少文章，先谢谢大家了。不过我还是有些不了解： 1、大家做蛋白酶体相关实验时，蛋白酶体需要纯化吗？一般怎么纯化？ 2、做蛋白酶体抑制剂的筛选相关步骤。 3、大家有没有谁做过蛋白酶体的表达的，亚基也行。 答：你去找一套叫 Methods in Enzymology的书，在 Volume 398 的PartB应该有你需要的东西 ...

问：我的一些菌株产蛋白酶，但是想具体分析就必须要高量纯化，这是个问题？如何提高产量？还有有人问我，既然每个菌株都会产生一系列的蛋白酶，那么什么样的才是可以达到商业利用价值的，难道随便一株菌只要分离纯化出蛋白酶就ok了吗？（比较simple的idea）谢谢各位！ 答：有多种因素影响菌株蛋白酶的产量，包括： 1、不同碳源对产酶的影响以及不同氮源对产酶的影响 2、碳氮比对菌株的生长和产酶有直接关系：例 ...

问：要抑制蛋白酶对细胞外基质的酶解作用，我想请教一下，在PH7-8之间蛋白酶的活性能够被明显的抑制嘛？因为PMSF毒性太大，还有没有别的抑制蛋白酶活性的试剂阿？EDTA能够抑制金属蛋白酶嘛？是不是跟EDTA螯合了Mg，Ca有关？ 答：许多细胞蛋白酶只有在溶酶体的偏酸性环境中才具有最大的活性，将pH调制中性将有助于使蛋白酶的活性降至最低，但是仍然不能完全消除它的影响，目前最常用的方法是通过加入蛋白酶 ...

问：我现在正在做神经细胞的培养，听说木瓜蛋白酶的消化作用比较好，购买后发现，不是简单的用三蒸水配制，有哪位高手能告之一二，万分感谢！ 答：我也用的sigma的木瓜酶，用hepes缓冲液很好溶的，一直没发现溶解度低的问题。 其实关于酶的选择，也不能简单的看消化作用如何，还要考虑到实验设计，比如说胰酶的消化效果总体尚可，特点是消化出的细胞电生理状态稳定，膜状态较好，但是胰酶对某些蛋白损伤很大，比如N ...

问：【求助】蛋白酶活性的测定方法：要对菌株进行蛋白酶的活性测定，不需要提纯，有什么合适的方法？同时介绍一下进行测定时以酪蛋白为底物的发酵培养基怎么配置？因为酪蛋白很难溶解。 答：你要一边加热一边调PH，碱性下酪蛋白会融解。用氨水或稀的氢氧化钠溶液调节，溶解很简单的。 答：蛋白酶的测定基本上都是经典的方法了，就是以酪氨酸做标准曲线的那个方法了。这是我测定蛋白酶的方法，先用酪氨酸作标准曲线。 &nbs ...

问：我用pH7.0 5mMTris-HCl缓冲液，含5mMCaCl2、0.02％叠氮化纳、0.5MNaCl，在4℃条件下提取黄鳝胰蛋白酶。具体方法是先将内脏打碎，离心，再用BAEE作底物在25℃，247nm处测胰蛋白酶活性，总是无功尔返。 不知道胰蛋白酶跑哪里去了，是酶失活还是自溶了，甚至是根本就没有分泌胰蛋白酶，怎样进一步保持酶的活性，恳请各位多多指教！本人不胜感激！ 答：原因分析如下： 1、 ...

问：我们知道明胶酶谱法可用来测基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性，但不知其他的基质金属蛋白酶活性的测定，比如我要测MMP-1、MMP-3的活性，是否也可用此法测定呢？急切盼复！ 答：首先应该弄清楚这些基质金属蛋白酶都属于哪一类型，才能考虑下面的问题。 你所提到的四种基质金属蛋白酶：MMP-1属胶原酶（Collagenases）MMP-2和MMP-9明胶酶（Gelatinases）MMP-3 ...

问：大豆胰蛋白酶抑制剂sigma有type-1和type-2两种，请问他们是怎么分类的，和kunitzbowman-birk有什么关系？他们对胰蛋白酶，凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶抑制的特异性如何？ 答：根据蛋白酶抑制剂所作用于蛋白酶的类型，大致可以将其分为四大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬酰胺蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂是研究较多的一大类，其中就包括您提到的K ...

问：急需木瓜蛋白酶（papain）和菠萝蛋白酶的核酸或者蛋白序列，可好像在Pubmed里检索不到，不知哪位大虾有这方面的讯息可提供，或者告知哪里可以查到，不胜感激！ 答：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&cmd=Search&term=AAA72774&doptcmdl=GenPept http ...

问：有谁知道酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？谢谢您的帮助。 答：下载这几篇文章看看：1、酸性蛋白酶高产菌株的选育http://www.wanfangdata.com.cn/qikan/periodical.articles/lsyslgy/lsys99/lsys9903/990313.htm2、酸性蛋白酶高产菌株6042（Aspergillus niger6042）的选育和形态鉴定http://eng ...

丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（其名字的由来）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。 弹性蛋白酶为水解酶类的一种，对丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸等含羧基的多肽键起催化水解的作用，因曾认为此酶主要作用于弹性蛋 ...

问：请教一个实验问题，PMSF，胃酶抑制剂以及DTT会不会影响HRP活性？要做ELISA，样品中不知道可不可以加复合蛋白酶抑制剂？请大牛指教！ 答：不会影响酶活性，因为蛋白酶抑制剂，抑制的是蛋白水解酶活性。而HRP不是蛋白酶类，而是过氧化酶。（不过dtt肯定会破坏HRP）。即使会影响酶活性，实际上做elisa也不影响，因为加样品和加hrp是分开的，不存在。 答：我在研究各种抑制剂对L－ ...

请问：有人知道蛋白酶产生菌的相关文献在哪里可以查阅的到？谢谢帮忙！ 答：用GOOGLE的学术搜索试试，可以找到一些文献，如这篇文章： 题目：弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究 下载地址：http://www.journals.zju.edu.cn/agr/2003/200301/030114.pdf 还有很多，到这里看看：按以下方法操作即可！http://scholar.google.c ...

问：简并引物的简并度并没有超过512，但是PCR时总是不能得到特异的带，只是在预定的位置出现一片弥散的带。后来提高模板浓度，并将退火温度从 50℃ 提高至65℃，做单引物对照即只加一条引物时能扩增出特异的带，而正常PCR却什么也扩增不出来，偶尔能扩增出一些片断也跟单引物对照的是一样的。并且重复性不好，有时能扩增出来有时什么都没有。确定模板没有问题，因为16S能扩增出来。请各位支招，感激不尽！ 答： ...

请问：测定微生物的脂肪酶活力时，油脂培养基中的花生油可以用豆油代替吗？ 答：首先应该分析花生油盒大豆油的主要成分，脂肪酶活力测定一般都用油酸作为底物。天然油脂中，分布最广的二烯酸是碳原子数为18的亚油酸（顺9，顺12-二烯十八酸），在所有植物油中几乎都含有亚油酸，棉子油、大豆油的主要成分是亚油酸。亚油酸为含有两个双键的不饱和脂肪酸。花生油中油酸的含量也在60％～80％之间，所以两者基本可以换用。 ...

问：请教大家一个问题，还请大家指教，我在用pNP(对硝基苯酚酯类)类物质测定脂肪酶活性时，用到一个摩尔消光系数，请问这个摩尔消光系数在不同的温度，不同的缓冲液，或者不同pH情况下能否通用？谢谢，请指教。 答：摩尔消光系数是由给定物质的特性决定的。实际上，被测定物质的摩尔消光系数也会在外界条件影响下发生变化，比如溶液的pH 值、反应的温度等等，同时也有和使用的仪器有关；所以说如果你要用到某一个摩尔消 ...

问：有人做过乳中脂肪酶的检测吗？除了传统的滴定法外，还有更好的方法吗？ 答：乳中脂肪酶没有测过，不过微生物脂肪酶可以用pNPP（对硝基苯棕榈酸酯）测吸光度法测活。 ...

问：我是做脂肪酶克隆表达的。现在已经将目的基因整合到毕赤酵母GS115中，可是几番诱导下来，就是没有酶活。现在小弟想请教各位战友几个脂肪酶活性检测的问题，怕是表达出来，因为检测方法有误。 1、诱导培养基BMMY的磷酸缓冲液浓度为100mmol/L，请问这个浓度是不是太高？如果脂肪酶表达量很低的话，测定过程中产生的游离脂肪酸也很少。如果活性测定的磷酸缓冲液浓度太高的话，会不会影响测定结果，也就是说将 ...

问：脂肪酶的测定方法有哪些？我的脂肪酶可能活性会很低，我要较灵敏的测定方法。 答：NaOH滴定法、酶标法、分光光度计法等等，有很多，国内相关的论文也有很多。 ...