PCR引物设计

茫茫的实验过程中，你是否遇到过如下的困境：做完 PCR，跑胶发现有多条很诡异的条带……更为可怕的是，做完二代测序发现了一个崭新的突变点，一代测序验证也能开心的验证出来，但发文章时，别人告诉我们，这其实是相似序列引发的假阳性……也就是说，相似序列之间的差异碱基，刚好就是那个所谓的突变点！一代测序也枉然！以上的问题，可能多半都是因为引物不特异。也就是说，同一对引物，能匹配基因组上好几个位置。所以，设计完引物，做一个在线的 PCR，以 ...

引物设计是 qPCR 非常重要的环节。今天小编给大家推荐 2 款简单实用的在线 qPCR 引物设计网站，让你分分钟搞定 qPCR 引物！Primer3 Plus推荐指数：五颗星理由：严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子，最好在 3' 端设计引物，产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。网址链接：http://www.primer3plus.com/1、选择 Run latest Versionof Primer3Plus，就进入了设计引物的 ...

分子信标的设计分子信标（Tyagi and Kramer 1996) 是另一种特异的荧光实时 PCR 探针（图 1), 这种分子信标可以在体内和体外动态地、实时地检测核酸 杂交事件（Tyagi and Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998)。图1分子信标是一段双重标记的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一个环（探针）和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在 5'端，猝灭剂在 3'端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告物质和 ...

除了为克隆基因、预测编码蛋白而需要研究基因的构成外，当前在基因组学上的努力也包括对基因组构成的研究，以分析具有结构和调控因子插入的基因。近源物种分析成为比较基因组学的主要内容，被认为是研究进化、基因功能和人类疾病的重要方法。利用该方法分析微生物，特别是细菌的基因组，早在 1996 年就已开始识别出细菌中的保守基因和与亚种相关的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。这方面的进展促生了新的、大规模的检测和识 ...

这个方法适用于检测或部分 DNA 片段克隆，不适合全长基因克隆设计策略反转录 PCR 的主要问题是基因组 DNA (gDNA) 污染的存在，这将导致产生假阳性信号，特异性降低或对特定 RNA 的过高估计。为了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干扰，可将引 物设计为与两个外显子的接合部退火，该点为 cDNA 序列专有，因此 gDNA 将不能被扩增。cDNA 特异的引物可通过三个途径设计（如下图所示）。第四章 cDNA、gDNA选择性引物设计1. 引物横跨外显子-外显子接合部。设计的引物如果一半与 ...

嵌套 PCR （nested PCR,nPCR）是指以第一次 PCR 产物为模板直接进行第二次 PCR 扩增，以增加 PCR 的灵敏度，第二次 PCR 设计的引物在第一次所用引物对的内部，这种引物被称为「内部」或 「嵌套」引物。以第一次 PCR 产物为模板进行第二次 PCR 扩增，可明显提高敏感度而对特异性无损（Albert and Fenyo 1990)。由于嵌套 PCR 使用两套引物对，在补充反应组分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙总循环数。如果不能进行完整的嵌套 PCR (使用两个内部引物），为提髙灵敏 ...

设计 PCR 引物时，下面这些因素你必须要知道。引物长度引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到 PCR 反应 是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。引物的解链温度PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应最优的 解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度 ...

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。设计策略MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一 ...

Oligo 6作为目前最好、最为专业的引物设计软件，Oligo的功能很强大，他主要功能有：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估「引物对」质量的功能，如何使用Oligo6 请参看：「两分钟教你学会 Oligo 7」Oligo 6 联合使用 Primer 5 http://wenku.baidu.com/view/da565dd380eb6294dd886c41.htmlBLAST BLAST（Basic Local Alignment Search T ...

86964109 请教大家，如果想检测某种miRNA的表达，而miRNA本身有5p和3P两种成熟体，那我设计引物是需要针对两种成熟体都设计么？还是任意一个都可以呢？谢谢！！行云流水19880112 现在我也有同样的困惑，不知您最后是怎么确定的？？？谢谢biohh 自己设计有点难度，很容易就把pre-miRNA检测出来了，建议你购买一些公司里设计好的引物那样比较好操作结果可信些！他们的引物是分3p和5p的。jmj_011 但是3p ...

z1206 小女子想请教一下园子里的各位战友们，除了上海生工还有哪家生物公司可以帮忙设计PCR引物啊？或者园子里哪位大侠可以帮忙呢？我一对引物，自己设计后没结果，请上海生工帮忙设计，他们也说太难，设计不出来，所以形势很严峻啊，拜托各位了！~~~~~~~zjubell 尽量自己设计引物，再不行，让师兄姐帮忙。失败的过程也是自己学习的过程。连引物都不会设计的硕士毕业生，呵呵，不说了。selleckchemcials 设计引物时首先可以查 ...

英实 illidancui 你做个温度梯度试试英实 谢谢哦本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

yolanda2122 我正在一个人源细胞的PCR，需要设计GADPH和LOX-1,THF-a,IL-1,IL-6,我用PUBMED搜出来的有些有好多选择，不知道该用哪一个啊，有没有高人指点一下，第一次做，完全没概念，谢谢zjubell 还是直接找以前的文献吧，人的么，大部分都有人做过了。http://www.rtprimerdb.org/http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/当然自己设计更能增长 ...

绣面芙蓉 如题，细菌做DGGE一般是用16S，真菌的有没有，ITS还是18S，GC夹要用什么，加在哪里，上游引物前还是下游引物前？我找过很多文献都没有找到完整的，如果能给出序列（包含GC夹）或者给出相应文献，丁当就奉送。zjubell FUNGI - UNIVERSALNameRegionFragment SizeSequence (5' to 3')ReferenceITS118S570–590TCCGTAGGTGAACCTGCGGWhite et ...

gretahill 我用NBCI的BLAST核对引物，下面出来的描述性的格里有accession,description, max score ,total score, query coverage, E value, max ident, links项目，这些都是什么意思？在核对引物可用性时哪些项指标较重要？谢谢qq890914 传个资料给你，自己学吧！gretahill 看中文比看英文舒服多了，非常感谢luwei2004 太好了，正需要这个。谢了！拿走了染景帆 好东西啊 ...

大鹏鸟 做microRNA反转录，查文献用到的是如下引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG(T)12Vundefined-3′，V_~L_A~E_G~E_C~J_N_~L_A~E_T~E_G~E_C.请问订购这样的引物应该怎么跟公司说啊？是就这么说呢，还是应该排列组合把所有可能的序列都告诉他？freecell 你只需要把序列这样递交给人家，合成的人懂的。在备注里说明一下V和N是什么。至少我在IDT和sigma就是这样递交的。价格都是按照碱基个数、合成规模、纯化 ...

xiaorui3510 敢问各位大侠怎么利用两种基因的同源序列来设计引物，比如说我用人源Mcl-1基因序列和褐家鼠源Mcl-1基因序列两者的同源序列来设计引物？希望不吝赐教！呵呵万分感谢。。。dolphin_705_200 你是想设计一对引物对两种种属的基因进行检测是吧。先将两个基因的序列进行同源性分析，然后在差异较小的区域设计引物即可。PCR时有几个碱基不匹配没有关系的，但是要注意，这些不匹配的碱基尽量不要在引物的3' ...

xumin520jie 谁能帮我设计一下14-3-3η的全长引物。需要加上酶切位点正义链 XhoI CCG（保护碱基） CTC GAG反义链 Xba CTAG（保护碱基） TCT AGA14-3-3η的全长序列其中 Cds 176..9161 tgcagccagc tagcgagaag gcgcgagcgg cggcgcagcc agcagcctcc cgccagccgg61 cgagccagtg cgcgtgcgcg gcggcggcct cggcggcgac cgggaagcgg acgggc ...

赵东生 哪位大侠知道有没有哪家公司提供MicroRNA引物（茎环+上下游）设计服务的啊？另外有没有相关软件啊？liqiangs invitrogen公司可以，颈环结构引物好像是ABI的专利，invitrogen和ABI合并了所以这方面应该是强项myskite 自己设计http://www.dxy.cn/bbs/thread/17643030#17643030本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验 ...

zx13763431 小弟新人，现在**犬类TGF-β1mRNA和内参照β-actin基因大小（bp数）？？小弟谢过了~把引物序列放在下面。谢谢各位大虾~~TGF-β1引物上游引物序列为:5’-GCTCCACGGAGAA-GAACAGGCTG-3’，下游引物序列为: 5’-CTGCTCCAC-CTTGGGCTTGC-3’；内参照β-actin引物上游引物序列为：5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’，下游引物序列为: 5’CTC ...