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        qPCR引物设计,Primer3 Plus 和 Primerbank 都能搞定!

        解螺旋

        45730

        引物设计是 qPCR 非常重要的环节。今天小编给大家推荐 2 款简单实用的在线 qPCR 引物设计网站,让你分分钟搞定 qPCR 引物!

        Primer3 Plus

        严格的 qPCR 引物设计一般要求其中一条引物要跨外显子,最好在 3' 端设计引物,产物的长度在 300bp 以内等。本在线软件可满足 qPCR 引物设计的要求。

        网址链接:http://www.primer3plus.com/

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        1、选择 Run latest Versionof Primer3Plus,就进入了设计引物的主页面,合理的使用<>,[],{} 符号使引物设计符合自己的要求,大家可以在具体实战中,深入体会这几个符号带来的方便。

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        2、避免多个重复碱基出现,避免 4 个或超过 4 个 G 出现在引物序列中。按照荧光定量引物要求设置参数,如产物长度:不应该超过 400bp,最好 100 - 150bp;GC%:30%- 70%,最好 45%-55%;引物长度:18 - 25bp,最好 22 - 24bp;TM 值:58 - 60℃,最好 60℃;3' 端:3' 端至少 4 个碱基保守,最好为 T,C,G。

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        3、点击右上放绿色按钮 Pick Primers,可获得若干对引物,并按照 5' 到 3' 的顺序,包含了引物和产物的一些基本参数。可以根据荧光定量引物要求,尽量选择 G、C 结尾的引物合成,如下图中红框所示,还可以在序列图中看到引物的位置。

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        4、设计好引物后,我们要进行 NCBI blast 引物验证,进入 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

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        5、点击 Basic BLAST 中的 nucleotideblast 选项,在下面框中,按照 5'-3' 顺序,分别输入上游引物和下游引物,上下游引物之间间隔 20 个以上 n。

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        6、选择物种数据库,如 Human,Mouse 或者 Others(如果是非人和非小鼠物种)。

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        7、选择 Somewhat similar sequences(blastn)

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        8、点击 Algorithm parameters, 在 Expect threshold 输入 1000,在 Word Size 输入 7。Word size 不是字体大小的意思,应该理解为读长,按照 7 个一组核苷酸序列放到 GeneBank 中进行比对。

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        9、点击 BLAST,开始比对,出现结果。颜色代表得分,选择引物的原则是:列表中大部分是目的基因,说明引物特异性高;但是可能物种不同,说明该基因在不同物种中保守。

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        Primerbank

        哈佛大学的一个 qPCR 引物数据库,目前有超过 20 万条引物,涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果,引物有效率为 82.7%。尽量选择这种验证过的 qPCR 引物,qPCR 品质比较有保障。

        网址:http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

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        搜索类型这里,可以根据 GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol 以及 keyword 六个选项进行搜索。以小鼠的 beta-actin 为例。

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        1、首先,到 NCBI 上找出β-actin 的 gene ID,如图,选择 gene, 输入 beta-actin:

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        点击右边的分类 musmusculus:

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        结果就出来了,小鼠 beta-actin 的 NCBI gene ID 是 11461,而 actb 则是小鼠 beta-actin 的 NCBI gene symbol。

        2、把 11461 输入到 primerbank 里面试试:

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        在这个结果上我们可以看到 beta-actin 的 NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length 等信息。

        3、若是改输入 beta-actin 的 NCBI gene symbol:actb,也可以得到相同的结果,往下拉我们还能看到经过验证的引物:

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        4、点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息:

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