RT-PCR

小鱼鱼小溪溪 条带有两条。一条为目的条带，479bp，另一条不知道是不是非特异性条带，241bp，两种条带都很清晰，如图所示:前三个泳道是样品，后三个泳道为内参。循环条件：94℃5 min；94℃30 S，60℃30 s，72℃30S，34个循环；72℃5 min。退火温度提高至62℃，仍然为两条条带，不知道是条件的问题还是引物特异性的问题，请教各位高手帮我解答。济南基美 如果普通PCR定量，可以不用管它，但从位置看是不是污染了内参的引物wgfki ...

kw412573902 大家好，有个十万火急的问题想得到大家的帮助：我们经过深度测序找到了一批rna，由于得到的序列结果是测序时的RNA经过公司逆转录并扩增成为PCR产物的序列，所以现在需要设计两个不同方向的逆转录引物，进行RT-PCR，确定RNA到底是正义链上的还是反义链上的序列，之前做的都挺好的，但是后来发现所有的序列都是两个方向都有的。。。而且之前的实验结果也重复不出来了。。。。我已经把所有RT-PCR过程中用 ...

lujunping 由于条件所限，标本只能放在-20度冰箱然后集中处理。请问，是否能够从组织中提取基因组DNA，然后通过RT-PCR的方法检测疾病组和对照组目的基因的表达水平吗？常用的方法都是抽提组织RNA然后逆转录为cDNA再检测的。谢谢！wangke80 基因组DNA和RNA是两回事，楼主首先得弄明白你们的研究目的是什么。表达水平肯定要用RNA了，基因组DNA不可能反应出两者之间的所谓表达水平。lujunping 疾 ...

vangolf 小弟一直在做NFkappaB与IkappaB，有几个问题一直搞不明白，查了一些文献也没查到什么内容1 IkappaB磷酸化及泛素化之后，也就是降解了，NFkappaB就可以入核，也就是说IkappaB的量下降了，我用RT-PCR法可以检测到IkappaB相关的表达吗？可果用RT-PCR方法得出IkappaB的表达随时间增强，是不是意味着有更多的IkappB与NFkappaB结合？我用RT-PCR方法检 ...

伽利略 检RT PCR测到a mRNA上调6倍，其蛋白上调15倍即蛋白比mRNA上调幅度大得多这说明了什么？a受到转录后调控还是怎么的？小薇宝宝 这很正常，起码趋势是一致的，其中有一些实验误差，也有翻译水平的调控存在伽利略 谢谢啊，如果不考虑实验误差问题，那蛋白比mRNA上调幅度大很多代表了什么，比如蛋白上调了100倍，mRNA只上调10倍。Fasta921 伽利略 wrote:检RT PCR测到a mRNA上调6倍，其蛋白上调15倍即蛋白比m ...

RT-PCR原理http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/130889_0.htmlhttp://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/Focus24_Top.htmRT-PCR基础http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/338601_0.htmlRT－PCR flashhttp://www.bio.davidson.ed ...

一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时 ...

基因表达之RT-PCR之我见在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想些点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT- ...

个人感觉做RT-PCR重要性排序:排第一的是引物,第二的是退火温度,第三才是模板.(1)引物引物可以自己设计或者参考自名牌期刊如5分以上的或本专业排名前四的期刊.因为这发表在这些期刊上文章的作者没有必要在方法学上造假,所以他们提供的引物序列是可信的.建议大家针对同一基因设计或者查找2对不同引物序列,合成一对引物时最好找2家不同的生物公司合成此物,如英俊(invitrogen),上海生工等.具体原因是,引物合成不可 ...

现在仍然以逆转录RT-PCR为主要技术手段之一来做课题的可能不很多了，但恐怕很多人在过去的研究项目中使用过或者正在使用RT-PCR。很多人都是用用beta-actin或者GAPDH作为内参的，并且也有不少文章发表过了。最近偶然发现2001年就有文章《Beta-actin--an unsuitable internal control for RT-PCR》发表反对千篇一律用beta-actin做内参照，原因可能还不止一点。下面是该文 ...

qPCR方法的准确性和可重复性一直备受争议。即使同一批样品、同一个人操作，在不同的时间点，可能会获得趋势一致，但是结果不同的的qPCR data。对于定量RT-PCR来说，获得一个误差小、重复性高的定量PCR结果，关键在于以下因素：1,从组织和细胞获得原始材料时，细心程度和可重复程度；2，RNA的抽提和纯化3，RNA的反转录4，将cDNA进行定量PCR扩增5，操作者“双手”的灵巧程度事实上，即使是那些非常有经验的PCR技 ...

RNA很脆弱,小心操作哦:实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用 ...

问 题 可能原因 建议解决方法 RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物 RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含逆转录抑 ...

为了方便大家系统理解操作RT-PCR，开个帖子,把有关有RT-PCR相关的问题一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。现在将每一页的主要问题整理一下1. RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2. 植物组织RNA提取的难点及对策3. 如何确定RNA质量的经验谈4. RNA提取常见问题分析RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国 ...

前面说到：请教各位前辈，我做RT-PCR做到悲痛欲绝，肠断无泪。请各位大侠帮我分析。我从培养细胞中提RNA，RNA电泳3条带清晰，比例均可。测RNA浓度，在0.5到3之间，用AMV及随机引物，37度1小时做RT， 以GAPDH（鼎国，400多BP）为内参做PCR，目的基因片段为584BP，反复做，目的基因及内参均未扩出，但可见引物二聚体，请问，那一步出问题？RT还是PCR？是否要换用MMLV（但MMLV扩长片段，我的基因是一短 ...

做RT也做了几次,有成功也有失败,在园子中受益良多,把我自已的一个流程放上来,供大家参考.细胞RT-PCR操作流程实验流程一 、取RNA：1、处理细胞：（1）贴壁细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞两次，弃尽PBS后，直接向培养瓶中加入1ml Trizol，通过溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。当Trizol量不足，可导致RNA中有DNA污染。（2）悬浮细胞：先用无菌DEPC水配制的PBS洗细胞，通过离心沉淀细胞，在 ...

实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反 ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...

定 量 PCR 技 术 简 介聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是微量核酸扩增的有效工具，由于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断。随着PCR技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR进行定量检测，即定量PCR技术，本文将对定量PCR的定量原理、技术 ...

厦门大学第四届荧光PCR─基础与应用研习班（2010年11月14日-11月20日，厦门大学分子诊断教育部工程研究中心）实时荧光PCR以特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭等优点，已成为基础生物学研究的重要平台技术，正成为临床诊断新一代标准技术，广泛应用于传染病、遗传病、肿瘤等领域。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，同时熟悉该领域的最新进展，厦门大学分子诊断教育部工程研究中心在2004、2006、2008年成功举办 ...