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        RT-PCR常见问题答疑解惑

        丁香园论坛

        1292

        问 题 可能原因 建议解决方法
        RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
        RNA被降解
        在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA
        使用良好的无污染技术分离RNA
        在将组织从动物体取出后立刻处理
        在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。

        RNA中包含逆转录抑制剂
        通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
        逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。
        将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

        多糖同RNA共沉淀
        使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
        用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
        确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
        对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。

        起始RNA量不够
        增加RNA量。
        对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

        RNA模板二级结构太多
        将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火
        提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
        注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。
        对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
        注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
        如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。

        引物或模板对残余的RNA模板敏感
        在PCR前用RNaseH处理
        靶序列在分析的组织中不表达 尝试其他靶序列或组织
        PCR没有起作用 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物

        PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
        PCR引物设计较差 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
        DNA含有抑制剂 诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA
        富含GC的模板 对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
        模板浓度太低 使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
        镁离子浓度太低 从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
        退火温度太高 使用公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

        PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物
        引物浓度太低 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

        RT-PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带
        引物和模板非特异性退火 在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
        GSP设计较差
        RNA中沾染了基因组DNA 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
        形成引物二聚体 设计在3'端没有互补序列的引物。
        引物和模板非特异性退火 以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
        在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
        使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
        避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。

        镁离子浓度太高 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
        因为扩增复杂模板导致引物错误起始 使用巢式PCR或递减PCR。
        沾染外源DNA 使用抗气雾剂的吸头和UDG
        因为二级结构导致引物结合位点无法接近 对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution。

        PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误
        聚合酶忠实性低 使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。
        循环数太多 降低循环数
        四种dNTP的浓度不同 制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。

        定量RT-PCR无扩增产量
        相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照

        无cDNA合成
        cDNA合成温度太高 降低保温温度
        反转录cDNA产物被二级结构封闭 提高保温温度。重新设计引物
        RNA被损害或降解
        荧光探针无功能 确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。
        用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。
        必要的话设计和合成探针。


        灵敏度低须在比预期更高的循环中检出产物

        初始模板RNA不充分 增加模板RNA的浓度;使用10ng-1µg的总RNA
        RNA被损害和降解
        必要的话更换RNA
        RNAse污染 维持无菌条件;加入RNase抑制剂

        无效的cDNA
        通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
        无效的PCR扩增
        注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺
        调整cDNA合成温度或引物设计


        信号高于预期在低于预期的循环中即可检出产物
        反应中加的样品太多 降低模板的浓度
        模板或PCR残余污染 隔离污染来源,更换试剂
        使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。


        电泳后出现意外的条带 RNA

        被基因组DNA污染 用DNase I预处理RNA
        用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 使用基因特异性引物
        PCR的低特异性 优化PCR条件

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