DNA酶切相关技术

酶切基础知识酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从 ...

双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUF ...

如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！1.PCR产物的酶切。PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:PCR产物的酶切相关的帖子：http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/242899_1. ...

最近总是看到一些战友发帖求助有关酶切方面的问题，因为它影响到了后续的重组质粒构建，而且似乎都无从说起。但我认为考虑全面了还是有章可循的。1 ：目的载体的控制无论它是空载体还是已经插入片段的载体，都必须保证：A ：质粒最好新鲜抽提，且抽提后电泳显示正常。质粒的长期保存形式建议以平板上的单克隆置于四度或者冻干状态于负20度，菌种尽可能以高浓度甘油状态置于负80度。B ：质粒的多克隆位点经测序后显示正确，尤其是表达载体，需要用 ...

酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA ...

精华【连接转化讨论专栏】 连接反应大全 【鸡毛蒜皮】之5－连接反应中巧用内切酶 连接技术讨论区PCR与连接PCR连接关于PCR产物及酶切产物与载体的连接 PCR产物与表达载体连接的问题PCR产物能够直接用做T-载体的连接吗平端连接 平端连接高手（讨论专贴）平端连接平端连接的怪现象? 平端连接的怪现象(2)平末端连接的条件？ 平末端连接构建载体的一些个人经验连接问题集 连接的问题关于连接偶的连接问题！还是连接问题求助：DNA连接问题关于连接的 ...

问题：原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割：1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如S ...

加分作为鼓励，因为有的问题还需要继续讨论！谢谢！第一次做双酶切连接有90％连接成功率（挑了24个克隆），重复性也不错。兴奋之余，相与丁香园各位战友一起分享经验，因为以前得到了许多帮助。准备：目的片段PCR产物胶回收，用乙醇沉淀法纯化胶回收产物，并经紫外分光光度计计算其浓度（A）质粒同样经乙醇沉淀法纯化，测定纯化产物的浓度（B）酶切：目的片断和质粒分别进行双酶切，大约10单位酶能完全切断1μg左右的DNA片断(A/B) 1 μg酶1 ...

最近我正准备构建真核表达载体，涉及到在引物上添加酶切位点的问题，在园子里搜罗了好久，我把部分比较好的帖子整理了一下，欢迎大家补充或参与讨论（请求加分）。一，关于带酶切位点引物的设计和选择,希望以下的建议能对你有所帮助:1.要构建一个包含外源基因片段的质粒载体,所以在选择酶切上必须根据两方面共同选择:质粒多克隆位点区域包含的酶切位点以及您需要的外源性DNA片段上的酶切位点.在设计引物的时候,你所加上去的酶切位点必 ...

前一段时间一直在做酶切连接,特别难连,做了两个月,终于被我揪出来了,现就我所遇到的问题和我自己的摸索,经验,教训,一一列出来,希望对大家有所帮肋.我做的是酵母双杂交,需构建的是目的片段B接入载体PM中,以及目的片段A接入载体PVP中.其中B 1130bp,A 3760bp.1.多扩几管,得大量的高保真PCR产物.(多扩几管,因为后面的实验中你会发现每切一次产物越来越少)2.PCR后进行切胶纯化(这步必须切胶纯化,因为决不可在产 ...

我想把目的基因连接到载体上，有几个问题想请教斑竹和各位战友：1、限制性内切酶的选择：我查看论坛说选择酶切位点需要考虑酶切位点在载体上的距离、酶切温度与连接效率、价格、使用频率等等。最后我综合价格、温度、Buffer选定XbaI和EcoRI，打算购买宝生的酶，相应的Buffer用附带的10×M Buffer。不知道我选择的酶切位点合适不合适呢？2、引物设计：引物结构为：保护碱基＋酶切位点＋目的基因末端上游引物5’－CCG TCT ...

一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有 ...

1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。2、 回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp× ...

AFLP原理：AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择 ...

结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶技术背景：克隆目的基因，并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中，是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分，随着载体设计技术的发展，双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。具体实验流程如下：设计合成含有酶切位点，能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载 ...

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1. 回收PCR产物在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位 ...

1．目的 学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。 2．原理 利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。 3．器材 旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌 ...

【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法，以β－半乳糖苷酶系 ...

限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在5 ...

利用荧光显微镜可以对单个枯草杆菌细胞内DNA的修复组装和 DNA复制复合物进行成像，特别是可以成像错配修复蛋白，SOS诱导蛋白及同源重组、DNA复制状态。