DNA基础知识

相关专题 DNA连接与转化 实验目的 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义; 学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化子的方法。 实验原理 转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。 转化混合物中的DN ...

相关专题 DNA连接与转化 一. 概念 1.transformation 特指以质粒DNA或以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。 2.transfection 指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。 3.感受态与致敏过程 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。 二.转化 ...

相关专题 DNA连接与转化 1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但 ...

相关专题 DNA连接与转化 重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。 1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中，37℃摇 床培养过夜。 2. 次日取菌液 0.2-0.5ml，13000rpm×3min 离心，弃上清，加入 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 一、 实验目的 学习外源DNA导入原核生物细胞的方法 二、 实验内容 热激处理将外源质粒DNA导入原核细胞。 三、 实验原理 利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便 ...

相关专题 DNA连接与转化 1. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条(小于0.6g)捣碎，置于1.5ml离心管中; 2. 加入等体积的Tris-HCl饱和酚(pH 7.6)，振荡混匀; 3. -20℃放置5-10min; 4. 4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中; 5. 加入1/4体积H2O于含胶的离心管 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 连接: 目标片断回收后立即与pGEM-T载体做连接反应。反应体系：2X连接buffer 5μl，回收产物 3μl，T载体 1μl，T4连接酶 1μl，共10μl;混匀，4℃放置16小时以上 转化: 1、从-70℃冰箱中取40μl感受态细胞悬液冰上解冻。 2、 加 ...

相关专题 DNA连接与转化 “选择”(selection)和“筛选”(screening)的基本含义。 选择，是指通过某种外来附加压力(或因素)的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。选择所涉及的范围较为广泛，包括根据克隆载体提供的表型特征的简单选择(simple selection)，和根据突变的互补作用对克隆基因的直接 ...

相关专题 DNA连接与转化 X-gal溶液配制方法 X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成的20mg/ml的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。 IPTG溶液配制方法 IPTG为异 ...

相关专题 DNA连接与转化大肠杆菌的基因工程 冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤 1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。 2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。 3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。 4. 加入0.9ml LB液体(提前37℃预热)，于37℃恒温摇床上2 ...

相关专题 DNA连接与转化 什么是标记基因和报告基因?常用的标记基因和报告基因有哪些? 标记基因(marker gene)是一种能够起特异性标记作用的基因。通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。 报告基因(reporter g ...

相关专题 DNA连接与转化 1 基本原理 转基因技术是当今生命科学研究领域最基本的技术。利用转基因技术改变物种的遗传性状从而获得新的品种或产品则是包括基因工程在内的生物技术产业的主要研发内容。 在下面的小实验中我们将通过基因转化的方法把一种对氨苄青霉素敏感的大肠杆菌转化成能抵抗氨苄青霉素的大肠杆菌。其基本原理是:细菌中存在一种环状DNA叫做质 ...

相关专题 DNA连接与转化 SOC培养基 成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖(18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌)。 TB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨12g 酵 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程基因工程让一切皆有可能 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 在这里必须指出的是，处于生物安全考虑，生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 在T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验中为什么DNA会留在细菌的细胞里而蛋白质不会?并且噬菌体的DNA是怎样进入细胞的? 噬菌体侵染细菌的过程2009-04-10 12:49(感染阶段 ) 噬菌体侵染寄主细胞的第一步是“吸附”即噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上然后进行“侵入。先通过溶菌酶的作用在细菌的细胞壁上打开一个缺口 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 O是指O抗原，也就是体细胞抗原，是包埋在细菌细胞壁中的脂多糖类;H是指H抗原，也就是鞭毛抗原，是蛋白质类，具有免疫性的结构。除此之外，还有K抗原，也就荚膜抗原，大部分是多糖;以及M抗原，类粘蛋白，多糖类。 大肠杆菌根据这四种不同抗原类型来进行血清学上的分类和分析。 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(E.I"IEC)、肠黏附性大 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 ⑴、细胞的生长状态和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 操纵子学说： 1961年，法国科学家莫诺(J·L·Monod，1910-1976)与雅可布(F·Jacob)发表“蛋白质合成中的遗传调节机制”一文，提出操纵子学说，开创了基因调控的研究。四年后的1965年，莫诺与雅可布即荣获诺贝尔生理学与医学奖。 莫诺与雅可布最初发现的是大肠杆菌的乳糖操纵子。这是一个十分巧妙的自 ...

相关专题 大肠杆菌的基因工程 1、获取目的基因。用限制性核酸内切酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平 ...