DNA转化及重组子的筛选

相关专题

DNA连接与转化

实验目的

了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义;

学习外源DNA转化 入受体菌细胞并筛选转化子的方法。

实验原理

转化(transformation)是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。其原理是细菌 处于0℃， CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入细胞的DNA分子 通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子 的受体细胞。

基因导入方法:

1)电击法 (Gene transfer by electroporation)

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基因导入方法:

2)基因枪法(Biolistic-bombardment)(植物细胞)

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Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell

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Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium

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DNA重组

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外源基因插入与否可通过载体上的Lac Z基因进行初步的筛选。有外源基因插入的细菌呈白斑，无外源基因插入的细菌呈蓝斑。

Alfa互补

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实验仪器、材料与试剂

(一)仪器

1. 恒温摇床

2. 超净工作台

3. 恒温水浴锅

4. 恒温箱

5. 微量取液器

(二)材料

1. 实验四所得连接产物

2. 实验五制备的大肠杆菌感受态细胞

(三)试剂

1. LB固体培养基

2. 氨苄青霉素(Amp) 100mg/ml

实验步骤

转化:

1.取适量连接产物加到分装的200 &mu;L感受态细胞中，冰上混匀，冰浴30min;此过程中，需倒含氨苄的LB平板。

2.42℃热激90s，迅速在冰浴中冷3-5min;

3.上述管中加入600&mu;L LB培养基，于37℃振荡培养45min;此过程中，在LB平板上涂布X-Gal 40 &mu;L和IPTG 20 &mu;L 。

4.取适量菌液涂布LB平板(含Amp 50&mu;g/ml)，室温涂布均匀后(至菌液完全被吸干)，于37℃倒置，过夜培养;

5.观察菌落，筛选阳性克隆。

实验结果与讨论

经抗生素初筛长出的细菌常出现假阳性的现象，为确定外源基因已转化入细菌，需另外的酶切和PCR验证。

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