DNA基础知识

生化方法l 磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞1. 转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育20～24 h。转染前1 h换液。2. 按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5 ml灭菌塑料管内混合100μl 2.5 mol/L Ca ...

调节瞬时转染基因的表达l 四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物阶段一：pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞培养和转染细胞1. 在DMEM完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有0.5μg/ml四环素-HCl（四环素）的DMEM完全培养液中。每个10 cm培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有33%的汇合度。2. 在合适的限制性内切酶位点使质 ...

CDNA文库筛选（一）λgt11 cDNA文库铺平板宿主细菌制备1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。2．将过夜培养物以3000×g离心5min。3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-ClpH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。4．细胞悬液可 ...

差减cDNA文库法第一条链cDNA合成1．合成第一条cDNA链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：10×第一条链合成缓冲液 5.0μl10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(终浓度1.25mM)Linker primer(1.4μl，终浓度100μg/μl)DEPc H2ORNase block Ⅱ(1U/μl) ...

差异显示法原理：该实验方法是针对从特定细胞或组织类型的mRNA池来源的样品用PCR技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法。该实验方法倚赖两套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。锚定反义引物是与mRNA的poly(A)尾及3’-非翻译区的连接处相复性结合。正义引物是一种10-mer的随机引物，将锚定引物与随机引物加入反应混合液，用PCR技术进行双链cDN ...

胚胎中细胞基因打靶方法置换型设计物的制备1．选择靶基因的一个部分作为设计物的组成，还包括有靶基因的另一个部分作为Southern杂交探针，以鉴定细胞中是否已发生同源重组之用。2．在质粒载体中构建一个克隆；neo基因能阻断靶基因的表达，在neo的两侧保持保留同源区；在同源区外的置换型设计物中包含一个胸腺嘧啶激酶（TK）基因。3．用限制性内切酶消化设计物DNA使成线形；设计物DNA线形化后，质粒DNA ...

纯合克隆筛选1．融化杂合突变ES细胞，ES/LIF培养液培养，每2～3天传代，实验开始把细胞接种到三个100mm铺有凝胶碟皿中，每皿接种1～2×106细胞。为筛选需用一个以上的ES杂合突变细胞系，因不同细胞系的转化效率不全相同，另外对检测细胞表型也需如此。2．每皿细胞分别加入1.0～2.0mg/ml的G4178（终浓度，pH7.4）；应用neo和hyg基因作为筛选标记效果都很好，用hyg时浓度为1 ...

RFLP法1）常规制备DNA盐析法1．用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。2．每3ml细胞悬液加10ml红细胞裂解液溶解红细胞两次，再加2ml白细胞裂解液溶解白细胞。3．加50μl 10％ SDS和70μl蛋白酶K消化蛋白质，37℃过夜或55℃ 3h。4．加0.25体积饱和醋酸钠溶液，剧烈摇动15s。5．2000r/min离心15min，收集上清。6．加入2.5倍预冷无水乙醇沉淀DNA，－20 ...

PCR－RFLP法1）提取细胞总DNA方法同前。2）PCR扩增引物的设计1．引物长度一般为15～30bp，G＋C含量应在45％～55％之间。2．应避免连续出现4个以上的单一碱基。3．不能含有自身互补序列。4．两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体。5．与非特异扩增序列的同源性应小于70％，或少于连续8个互补碱基。6．扩增HLA-D区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子 ...

PCR－SSO（ASO）探针法1）常规提取DNA参见RFLP法2）PCR扩增参见PCR-RFLP法3）斑点杂交1．将5～20μl扩增产物，加变性液100～200μl室温处理5～15min。2．在尼龙滤膜（预先用2×SSC浸湿2min）上真空点样，每孔以10×SSPE 200μl冲洗，抽干，80℃干燥2h。3．标记探针，取标记缓冲液2.5μl，寡核苷酸片段（dCTP dGTP dTTP）50～1 ...

PCR－SSP法1）提取DNA同前RFLP法2）PCR扩增操作方法基本同PCR-RFLP，但引物是根据各等位基因的核苷酸序列设计的特异性引物，主要是针对第二外显子区域的多态性，用SSP扩增出来的产物具等位基因特异性。3）凝胶电泳取PCR扩增的产物与上样缓冲液混合，加入2％琼脂糖凝胶加样孔中，其内加入溴化乙锭，在电压15V/cm凝胶条件下电泳20min，然后在紫外灯下照相分析结果。 ...

PCR－指纹图法1）提取DNA同前RFLP法2）PCR扩增同前PCR-RFLP法3）凝胶电泳取PCR产物10μl，加2μl的6×上样缓冲液，经12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，200V，2～3h。再用溴化乙锭染色30min，照相分析结果。 ...

PCR－SSCP法1）提取DNA同前RFLP法2）PCR扩增同前PCR-RFLP，也可加入1μCi32P-dCTP标记产物。3）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1．取PCR的扩增产物，加凝胶加样液3μl，95℃加热变性2min，冰浴骤冷。同位素掺入的DNA取1μl稀释10倍，加样3μl。2．取样品用微量加样器加入非变性聚丙烯酰胺凝胶样品孔中，200V电泳过夜。4）放射自显影1．未掺入同位素的PCR产 ...

几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。RNAi肯定有很多新用途，RNAi还可能具 ...

　　自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的 诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对 诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月 前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两 ...

　　骨肿瘤较罕见，恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%，男多于女，性别比约为1.6 ∶1，均好发于10-30岁间，良性者以骨软骨瘤最多，依次为骨巨细胞瘤、内生软骨瘤 等，恶性者以骨肉瘤最多，依次为软骨肉瘤、纤维肉瘤等.骨恶性肿瘤的发生机理目 前认为是癌基因显性作用与抗癌基因失活的结果，是多种癌基因多阶段多途径协同作 用的结果.骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系，受 多种相关 ...

　　基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要 ＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确 ...

　　自从1985年PCR技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断，利用PCR技术诊断遗传病的途径有五个，①基因突变位点 的直接检出②筛查与遗传病③④有关的点突变③遗传多态性标记连锁分析间接诊断④ 利用cmRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析cmRNA.　　传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法，包括 Southerninn ...

　　经典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria简PKU)是由苯丙氨酸羟化酶(PAH)的遗传性 缺陷引起的一种先天性代谢病，其发病早在我国以为1/10000左右，杂合子频率为 1/50.PKU的临床表现　　PKU患儿由于苯丙氨酸羟化酶的缺乏或不是使苯丙氨酸在休丙大量堆识，并经旁 路代谢途径产生一系列的毒性代谢产物而该小儿产生一系列的明显中毒症状.患儿在 刚出生时，由于无苯丙氨酸的摄入因此无临 ...

　　血友病A是常见的遗传性凝血障碍，它是由凝血因子Ⅷ的基因缺陷而致其功能异 常的致其发病率改为1/1000男性，女性患者极为少见.在临床上，血友病大都有家族 史，亦有约20～30%的患者为散发病例，为新生基因突变所致.一、血友病的遗传学　　本病为X连锁隐性遗传病，其基因定痊于Xq28.因子Ⅷ(FVⅢ)基因全长约为186Kb， 包括26个外显子和25个内含子，其mRNA全长约为9Kb，CDNA占为 ...