差减cDNA文库法

 

差减 cDNA 文库法

 

[ 第一条链 cDNA 合成 ]

1． 合成第一条 cDNA 链时，所有试剂应按下列顺序依次加入：

10 ×第一条链合成缓冲液                  5.0 μ l

10mM dNTP Mix(1.4 μ g/ μ l)               2.5 μ l( 终浓度 1.25mM)

Linker primer(1.4 μ l ，终浓度 100 μ g/ μ l)

DEPc H₂ O

RNase block Ⅱ (1U/ μ l)                   1.0

mRNA                                  1~5 μ g

混合，离心 20 秒钟，室温放置 10 分钟

2． 加入逆转录酶至 1500U/ml ，补水到终体积 50 μ l 。

3． 混合，取出 5 μ l 放入含有 0.5 μ g α -³² P dATP （ 800Ci/mM ），分别保温在 37 ℃ 1 小时。

4． 保温后，带有同位素的离心管放入 -20 ℃保存，为以后分析用。第一条链 cDNA 混合物放在冰上。

 

 

[ 第二条 cDNA 链的合成 ]

1． 对于总体积为 45 μ l 的第一条链混合物按下列次序依次加入：

第一条链混合物                     45.0 μ l

10 ×第二条链缓冲液                  20.0 μ l

0.1M DTT                          8.0 μ l

10mM dNTP Mix                     3.0 μ l

α -³² P dATP （ 800Ci/mM ）             1.0 μ l

dd H₂ O                           115.0 μ l

2． 混合后，加入：

RNase H (4.0U/ μ l)                   1.0 μ l

DNA 聚合酶（ 10.0U/ μ l ）             7.0 μ l

第二条链反应体积 200 μ l ，在 16 ℃水中保温 2.5 小时，注意水温不得超过 16 ℃，保温后立即放在冰上。

3． 反应混合物随后用酚，氯仿提取

4． 用乙醇沉淀于， -20 ℃过夜。

5． 次日，在 4 ℃，以最大速度离心 1 小时。

6． 用 80% 乙醇洗一次。

7． 冷冻干燥 cDNA 。

8． 最后沉淀物溶于 43.5 μ l 的 dd H₂ O ，取出 4.5 μ l 存入冰箱，作为第二条链分析用。

 

 

[ 填补 cDNA 末端 ]

1． 在 39 μ l 的 cDNA 溶液中加入 : 5.0 μ l 的 10 × T4 DNA 聚合酶缓冲液， 2.5mM dNTP 混合物。

2． 反应物在 37 ℃保温 30 分钟。

3． 酚，氯仿提取。

4． 酒精沉淀 cDNA ， -20 ℃至少沉淀 30 分钟。

5． 在台式离心机中，以最大速度 4 ℃离心 60 分钟。

6． 80% 乙醇洗涤沉淀。

7． 冷冻干燥 cDNA 沉淀。

 

 

[ 连接 ]

1． 在反应总体积 10 μ l 中，应有：

1 μ l 10 ×连接缓冲液

1 μ l 10mM ATP

1 μ l (4 Weiss U/ μ l)

T4 DNA 连接酶，连接子或者 Adapter

2． 反应在 8 ℃保温过夜。

3． 保温后，反应离心管放于 70 ℃ 30 分钟，以灭活 DNA 连接酶。

 

 

[cDNA 末端磷酸化 ]

1． 70 ℃灭活反应后，稍微离心一下，置室温 5 分钟。

2． 在反应混合物（ 10 μ l ）中加入：

1 μ l 10 ×连接缓冲液

2 μ l 10mM ATP

1 μ l （ 10 μ） DNA 激酶

 

 

[ 限制性内切酶消化 ] 以得到粘性末端

1． 限制性内切酶消化 DNA 和载体。

2． 在 37 ℃保温 1~5 小时，然后冷却到室温，如果选用定向插入，需用两个不同的限制性内切酶消化，可得到两个不同的粘性末端。

 

 

[cDNA 大小的选择 ]

1． 在 50 μ l 的总体积中加入 5 μ l 0 × STE 缓冲液。

2． Sephacryl S-400 柱收集分离出的 cDNA 。

3． 用酚，氯仿抽提。

4． 酒精沉淀之后，悬浮 cDNA 在 10 μ l 的无菌水中。

[cDNA 和载体连接 ] 载体可用λ gt10, λ gt11 或λ ZAP Ⅱ

cDNA (0.1~1 μ g)                      2.5 μ l

10 ×连接缓冲液                        0.5 μ l

10mM α ATP                         0.5 μ l

载体（ 1 μ g/ μ l ）                       1.0 μ l

T4 DNA 连接酶（ 4 Weiss U/ μ l ）         0.5 μ l

总体积为 5 μ l

12 ℃保温过夜，或 4 ℃两天，然后放在室温下 2 小时。

 

 

[ 包装 ] 试剂由 Strategene 制备

1． 包装提取物从 -70 ℃取出立即放入干冰中。

2． 同时化解超声提取物（黄色）。令在手指间溶解冻红色管，到刚刚开始化时，加 1 μ lDNA 置于冰上。

3． 快速加 15 μ l 超声提取物到 DNA 中，仔细混合，避免气泡，在室温下保温 2 小时（ 22 ℃）。

4． 加 500 μ l 噬斑稀释缓冲液（ SM 溶液），再加 20 μ l 氯仿，温和的混合。

5． 离心弃去噬菌体碎片。这个 cDNA 文库可以测效价，保存于 4 ℃中。

 

 

[ 制备 ZAP Ⅱ文库的单链 cDNA]

1． 在一个 50ml 的圆锥形离心管中，加宿主菌 250 μ l 到 SM 液中：

SM 液： 20mM Tris pH7.5

        100nm NaCl

        10nM MgSO₄

        0.2% Gelatin

2． 37 ℃保温 15 分钟后，加 5ml 2 × YT （其中每升溶液含 10g NaCl, 10g 酵母提取物， 16g 胰酶解胨）， 37 ℃摇 5 小时。

3． 然后在 70 ℃保温 20 分钟。

4． 4000g 离心 5 分钟，以除去细菌裂解碎片。回收上清液。这里应含有诱导得到的单链重组噬菌体，同样还会有辅助噬菌体。滴度可以按细菌的形成单位来计算。

 

 

[ 大量制备生产单链噬菌体 DNA]

1． 新鲜过夜培养的宿主菌 XLI-Blue ，以 1 ： 20 稀释在 LB 培养液中，在 37 ℃培养扩增 2 小时。

2． 加 1ml 含单链 cDNA 的上清液。

3． 再于 37 ℃继续培养 2 小时。

4． 然后将全部溶液转到 500~1000ml LB 中，生长 5~6 小时。

5． 9500 rpm 离心 60 分钟，除去细菌碎片。

6． 向上清液中加等体积的 20% PEG ， 3.5M 醋酸胺溶液，室温下沉淀 30 分钟。

7． 9500 rpm 离心 45 分钟，把 PEG 沉淀悬浮在含有 405mg/ml 的 SM 溶液中， 23 ℃ 35 000rpm 离心 16~24 小时，在管上部附近，噬菌斑会形成一个可见带，针刺法收集可见带，并对 SM 溶液透析，最后以酚、氯仿抽提，酒精沉淀噬菌体 DNA 。

 

 

[ 生物素标记 ]

1． 取来自一个文库的单链 cDNA ，先用生物素标记后，再与另一个不加生物素标记的 cDNA 以 10 ： 1 进行杂交。

2． 生物素标记物来自 Vector Laboratories ，取 100 μ g 的单链 DNA 溶解在 HE 缓冲液中， HE 缓冲液为： 10mM HEPES pH7.5, 1M EDTA.

3． 100 μ g/ml 超声粉碎。

4． 酒精沉淀，溶解在 100 μ lHE 缓冲液中。

5． DNA 与 100 μ l 重组的 Photoprobe 生物素充分混合。

6． 然后暴露在 275W 的太阳灯下 15 分钟，混合物与照射距离灯 10cm ，再重复一次，共 30 分钟。

7． 混合物用正丁醇抽提 4 次。

8． 乙醇沉淀，沉淀物再悬浮于 100 μ l HE 缓冲液中。

 

 

[ 差减杂交 ]

1． 100 μ g 的生物素标记的单链 cDNA 与另一个文库的 10 μ g 的未经生物素标记的单链 cDNA 乙醇共沉淀。

2． 加入： 5 μ g Poly A(Pharmacia), 5 μ g Poly C(Pharmacia) ，溶解在 10 μ l HE 缓冲液中。

3． 把这 10 μ l 混合物加到 10 μ l 杂交混合物中，此杂交混合物含有：

1.5m NaCl

50mM HEPES pH7.5

10mM EDTA

0.2% SDS

总共 20 μ l

4． 把样品紧紧地封在一个硅化过的 0.75 μ l 的微量离心管中。

5． 煮沸 1 分钟后。

6． 浸在 68 ℃水中 20 小时。

7． 杂交后的差减物用 Streptavidin-Phenol 提取除去杂交的 DNA 。

8． 用乙醇沉淀后再悬浮于 20 μ l 2mM Tris pH7.5+0.1 M EDTA 溶液中。

9． 取 5 μ l 单链 cDNA ，加：

5pmole 的引物                                    1 μ l

引物粘合缓冲液（ 20mM Tris pH7.5, 50mM NaCl ）      2 μ l

H₂ O                                             2 μ l

总体积为                                         10 μ l

10．  68 ℃保温 10 分钟，使引物和 cDNA 粘合，再慢慢冷却至低于 30 ℃，大约需要 2 小时。

11．  10 μ l 的体积稀释到 50 μ l 的反应缓冲液中，反应缓冲液组成为： 10mM Tris pH7.5, 7mM MgCl₂ , 1mM DTT, 50mM dNTP 。

12．  加 10 单位的 Klenow 聚合酶， 37 ℃保温 2 小时。

13．  反应物用于转化大肠杆菌。转化用 LB 琼脂糖平板，琼脂平板含有： 50 μ g/ml 青霉素， 50 μ l 2% 的 X-gal ， 100 μ l 0.1M IPTG 。

14．  用无菌牙签挑出所有白色菌落，于 96 孔板中，每孔中含有 100 μ l LB 培养液并含有 100 μ g/ml 青霉素。

15．  把 96 孔板用石蜡膜包好，在 37 ℃摇动过夜。

16．  第二天，在每孔中加入 100 μ l 高压效度过的 50% 甘油，再回 37 ℃摇动 1 小时， 96 孔板保存在 -80 ℃冷冻箱，稳定 1~2 年，这就是差减后的 cDNA 文库。