DNA基础知识

用考马斯亮蓝R－250染色1．凝胶的固定液中轻微摇荡至少1小时。2．凝胶在染色液中摇荡过夜或至少1小时。3．胶在脱色液中摇荡过夜或至少1小时以消除背景。4．凝胶放于保存液中至少4小时以进一步脱色。在最初的1小时内换两次溶液，以后每一小时换一次溶液。5．封好的胶置于保存液中，4℃下最少可保存5年。 ...

1．将固定液中的凝胶摇动过夜或至少1小时。2．将保温液中的凝胶轻微振荡2小时。3．去离子水清洗凝胶3次，每次20分钟。4．将硝酸银溶液中凝胶轻微振荡30分钟。5．用去离子水快速洗胶30秒。6．将定影液中凝胶摇动5～30分钟，时间由所加的蛋白质量决定。7．如果已经达到所需的颜色深度，将凝胶放到定影液中最少15分钟。8．换定影液。在暗处，4℃定影液中凝胶可保存几个月。 ...

1．IEF之后，用去离子水充分地清洗管子。2．加热500ml 0.6％ Deconex溶液至60～80℃。3．将玻璃管子浸入Deconex溶液，70℃下放置3次10分钟：每10分钟之后，分别用镊子移走玻璃管，倒出清洗液，加入新的清洗液，再于70℃下清洗10分钟。4．用去离子水浸洗管子。5．加热500ml 0.1mol/L盐酸至95℃。6．将管子放到一个玻璃烧杯中，加0.1mol/L盐酸，直到将烧杯 ...

随机引物法：利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记 1. 在一个0.5ml的微量离心管中加入溶于30μl水的模板DNA(25ng)及1μl随机脱氧核苷酸引物（约125ng）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中2min。2. 将微量离心管移至冰上放置1min，4℃下离心10s使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。3. 在引物与模板的混合物中 ...

相互作用在生理上的证实和探索l 通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液 ...

快速分析过去已确定的相互作用l 利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质RAMc通过伯氨基与CM-5传感芯片表面的结合1．将CM-5传感芯片模块嵌入BIAcore仪器。2．全部采用过滤并除气的HEPES缓冲盐溶液。3．将分别含有NHS、EDC、乙醇胺和RAM Fc以及20 mmol/L HCl各100μl的小管置于BIAcore自动进样器架的适当位置。4．将一个空 ...

叶绿体RNA的体外加工与紫外交联分析RNARNA的合成l DNA模板的线性化1．根据供应商的指导用合适的限制酶酶解含有DNA模板（如亚克隆在转录载体如pBluescript®（Stratagene）上的菠菜叶绿体psbA基因）的质粒（Schuster and Gruissem1991）。2．用DNA琼脂凝胶（Sambrook et al. 1989）分析线性化质粒以检查酶解是否完全。3． ...

荧光原位杂交的染色体分析（一）标本的制备1．室温下，依次用70％、90％和100％的乙醇脱水5min。2．空气干燥载玻片。3．若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化”（aged），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，－70℃保存。根据作者的经验，在6个月内使用的载玻片可贮存在－20℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。（二 ...

叶绿体mRNA3’末端的体外加工l RNA加工反应1．在1.5ml微量离心管中加入下列反应液：缓冲液IVT（20×） 0.5μl叶绿体蛋白提取物（20μg） Lμl缓冲液E

番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验步骤2～7须在4℃下使用高压灭菌过的设备进行。1．将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上，置于小盆内，用薄膜封口后，培养7天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。2．将40～50g新鲜组织放入300ml匀浆缓冲液，用韦林氏搅切器先1×4秒而后6×1秒。3．过滤匀浆混合液，使其透过漏斗上的4层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放置的3层Nitex尼龙筛网（300μm，100μm， ...

放射性标记DNA探针的制备l 聚丙烯酰胺凝胶的制备1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。l DNA的标记1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5 ...

放射性标记DNA探针的制备l 聚丙烯酰胺凝胶的制备1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。l DNA的标记1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5 ...

放射性标记DNA探针的制备l 聚丙烯酰胺凝胶的制备1．按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将10×TBE稀释成0.5×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝胶，小于100bp的片段应灌制6～8％的凝胶。l DNA的标记1．用两种限制性内切酶从10μg质粒上将待测DNA片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生5 ...

磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定l 磷酸化作用化学计量的确定1．在冰上建立下列反应混合液：Tris-HCl（50mmol/L；pH8.0）/MgCl2（10mmol/L） 250μlATP（10mmol/L） 1μl纯化的DNA结合蛋白（1mg/ml）&n

聚合酶链式反应体外扩增DNA1. 按以下次序，将各成分加在0.5 ml灭菌离心管、扩增管或灭菌滴定板的孔内混合：10×扩增缓冲液 5μl20 mmol/L 4种dNTP混合液（pH 8.0） 1μl20 μmol/L正向引物&nbs

PCR的优化在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。表1 PCR扩增的疑难解析问题解释补救措施目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈 ...

基因组文库法一）基因组DNA分离、纯化和加工酶检测1．准备1.5ml小试管4个；每管内含有：基因组DNA（在TE或水中） 10.0μg10×Mbo I缓冲液 2.5μlH2O

cDNA文库原理：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。l cDNA文库的构建分为六个 ...

在质粒载体中进行平末端片段的克隆 1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。4．将载体DNA去磷酸化 ...

原核细胞l 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建1. PCR修饰或限制性内切酶消化分离DNA片段，片段5’端和3’端带有与IPTG诱导表达载体对应的限制酶位点。2. 含靶cDNA/基因的DNA片段与表达载体连接。3. 重组质粒转化有lacIq 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有lacI基因，可以使用任何适当的 ...