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        利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记

        互联网

        1657

         

           随机引物法:利用寡核苷酸延伸法进行纯化 DNA 片段的放射性标记

         

        1.      在一个 0.5ml 的微量离心管中加入溶于 30 μ l 水的模板 DNA(25ng) 1 μ l 随机脱氧核苷酸引物(约 125ng )。盖紧微量离心管,置于沸水浴中 2min

        2.      将微量离心管移至冰上放置 1min 4 ℃下离心 10s 使引物与模板的混合物沉降至管底,将微量离心管重新置于冰上。

        3.      在引物与模板的混合物中加入:

        5 mmol/L dNTP 溶液           1 μ l

        5 ×随机引物缓冲液           10 μ l

        10 mCi/ml [ α -32 P] dNTP      5 μ l

        (比活性 3000 Ci/mmol   

                                 加至 50 μ l

         

         

        5 ×随机引物缓冲液:

         

        250 mmol/L Tris (pH8.0)

         

        25 mmol/L MgCl2

         

        100 mmol/L NaCl

         

        10 mmol/L 二硫苏糖醇( DTT

         

        1 mol/L HEPES( 4mol/L NaOH 调至 pH6.6)

         

        1 mol/L DTT 贮存于- 20 ℃,临用前用水稀释,使用后弃去稀释的 DTT

         

        4.      加入 5 单位(约 1 μ l )的 Klenow 片段,轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心 1 2s 使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应 60min

        5.      在反应液中加入 10 μ l NA 终止 / 贮存缓冲液,可根据需要进行以下步骤。

        NA 终止 / 贮存缓冲液:

        50 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)

        50 mmol/L NaCl

        5 mmol/L EDTA(pH8.0)

        0.5% (m/V) SDS

        贮存放射性标记的探针于 -20 ℃以备杂交用。

        通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA 。如果> 50% 的放射性 dNTP 已在反应中掺入,可不进行该步骤。

         

         

        另法

         

        1 1.5ml 微量离心管内依次加入:

        10 200ng 模板 DNA (溶于 1 9 μ l 水)

        灭菌双蒸水加至 9 μ l

        2 .离心管加热至 100 5min 即置入冰浴,短暂离心。

        3 .冰浴上依次加入:

        2 μ l 10 ×反应缓冲液

        1 μ l 0.5 mmol/L dATP (终浓度 25 μ mol/L

        1 μ l 0.5 mmol/L dGTP (终浓度 25 μ mol/L

        1 μ l 0.5 mmol/L dTTP (终浓度 25 μ mol/L

        5 μ l α- [32 P] dCTP (终浓度 0.83 μ mol/L

        1 μ l 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 大片段( 2U

        4 37 ℃温育 30min

        5 .当温育反应物时,同时制备 Sephadex G-50 自旋转, 2000 × g 离心 2 min

        6 .加入 2 μ l 0.2mol/L EDTA pH8.0 )终止反应。反应混合液装样至自旋柱, 2000 × g 离心 4min

        7 .取 1 μ l 柱洗脱液用液闪仪计数。用于杂交实验前,应将探针加热至 100 5min 使之变性,随即置入冰浴 5min

         

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